摘要：人外周血是容易獲取的人體樣本，在醫學類科研工作中至關重要。如何大化、高效地觀察和利用有限的人外周血標本，通過一次實驗檢測得到更多的結果指標，對現有的實驗研究意義重大。因此本文主要描述如何進行25色流式檢測及介紹相關分析方法，通過對單個細胞同時檢測25個參數，可以實現對外周血各種免疫細胞亞群的全景式描述，以及對某種細胞亞群的深度表型分析。

關鍵詞: 人外周血, 亞群分類, 25色流式分析

材料與試劑

材料：

1. 15 ml離心管 (Corning, catalog number: 430791)
2. 10 ml移液管 (Corning, catalog number: 4488)
3. 1.5 ml離心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
4. 96孔圓底板 (Corning, catalog number: 351177)
5. BD Falcon流式管 (Corning, catalog number: 352052)
6. 70 μm濾膜 (Corning, catalog number: 352350)
7. 肝素抗凝管
8.  
9. 試劑：
10. Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set (Ms Ig Kpa Comp Bead Set 6Ml, BD Biosciences, catalog number: 552843) 
11. Lonsera烏拉圭 (南美) 特級胎牛血清 (Lonsera, catalog number: S711-001S)
12. Lymphoprep (Stemcell, catalog number: 07851)
13. 20x PBS緩沖液 (生工，catalog number: B548117)
14. 0.5 mol/L EDTA (生工，catalog number: B300599)
15. Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl (Lonza, catalog number: 17-942E)
16. 1x PBS (見溶液配方)
17. FACS buffer (見溶液配方)
18. 抗體混合物 (見溶液配方)
19. 抗體：
20. Mouse antihuman CD32-BUV395 (BD Biosciences, custom)
21. Mouse antihuman CD16-BUV496 (BD Biosciences, custom)
22. Mouse antihuman CD19-BUV563 (BD Biosciences, custom)
23. Mouse antihuman IgD-BUV615 (BD Biosciences, custom)
24. Mouse antihuman CD4-BUV661 (BD Biosciences, custom)
25. Mouse antihuman CD64-BUV737 (BD Biosciences, custom)
26. Mouse antihuman CD14-BUV805 (BD Biosciences, custom)
27. Mouse antihuman CD57-BV421 (BD Biosciences, custom)
28. Mouse antihuman CD3-BV480 (BD Biosciences, custom)
29. Mouse antihuman CD27-BV711 (BD Biosciences, custom)
30. Mouse antihuman CD20-BV750 (BD Biosciences, custom)
31. Mouse antihuman CD197-BV786 (BD Biosciences, custom)
32. Mouse antihuman CD45RA-BB515 (BD Biosciences, custom)
33. Mouse antihuman TCRgd-BB630 (BD Biosciences, custom)
34. Mouse antihuman CD195-BB660 (BD Biosciences, custom)
35. Mouse antihuman CD8-Percp-cy5.5 (BD Biosciences, custom)
36. Mouse antihuman CD38-BB790 (BD Biosciences, custom)
37. Mouse antihuman CD11c-PE (BD Biosciences, custom)
38. Mouse antihuman CD13-PE-CF594 (BD Biosciences, custom)
39. Mouse antihuman CD123-PE-Cy5 (BD Biosciences, custom)
40. Mouse antihuman CD25-PE-Cy7 (BD Biosciences, custom)
41. Mouse antihuman CD127-AF647 (BD Biosciences, custom)
42. Mouse antihuman CD56-APC-R700 (BD Biosciences, custom)
43. Mouse antihuman HLA-DR-APC-H7 (BD Biosciences, custom)

儀器設備

1. 實驗室2級生物安全柜 (Thermo Scientific™ 1300 Series A2 Biological Safety Cabinet Packages)
2. 高速離心機 (Thermo Scientific™ Sorvall™ ST 40離心機)
3. 倒置相差顯微鏡 (Olympus, model: CKX41)
4. 血細胞計數板 (Sigma-Ardrich, model: BR717805-1EA)
5. X30流式細胞分析儀 (BD FACSymphony™系統)
6. 電動移液器 (Eppendorf, model: 4430000018)

實驗步驟

一． 人外周血免疫細胞的制備 (Gupta等，2013)

1. 準備潔凈的15 ml離心管，倒入3 ml lymphoprep。抽取健康人外周血置于肝素抗凝管中備用，在無菌的15 ml離心管中加入3 ml人外周血, 再加入3 ml 1x PBS后 (文中未特殊說明均為1x PBS) 進行混勻稀釋。左手傾斜離心管，右手用移液器吸取稀釋后的外周血緩慢加到lymphoprep表面，形成密度梯度。在加入外周血的過程中，可適當緩慢擺正離心管，注意加液體時要輕柔，移液器的速度調整到低，以免將lymphoprep和外周血混勻 。
2. 400 x g，20 min，升速 (ACC) 1，降速 (DEC) 0，室溫進行密度梯度離心。
3. 離心結束后離心管內液體分為5層，從上到下分別為：血漿，外周血單個核免疫細胞 (包括外周血單核細胞和淋巴細胞等)，lymphoprep，粒細胞，紅細胞 (圖2)。準備干凈的15 ml離心管，加入10 ml PBS，用吸管吸取第二層的外周血免疫細胞并轉入含有PBS的離心管中，上下顛倒后放入離心機800 x g，10 min室溫離心
4. 離心結束后去上清，輕彈管底，再加入10 ml PBS，上下顛倒后放入離心機400 x g，5 min室溫離心。
5. 重復步驟4清洗外周血免疫細胞以徹底去除殘留的lymphoprep。
6. 后得到的細胞沉淀就是外周血免疫細胞，可用PBS重懸細胞后進行細胞計數。理論上，1 ml外周血可得到1 x 106左右外周血免疫細胞。二． 25色流式染色實驗 (參考文獻1)

25色流式染色和正常流式染色步驟一致，本實驗研究的25色全景分析所用的抗體均為表面抗體，因此只需要進行常規流式表面染色。

1. 配制抗體混合物。一個反應體系為100 μl，按照抗體說明書建議的稀釋比例 (2.5 μl/test) 用FACS buffer (見溶液配方) 對不同的抗體進行稀釋。
   注：由于體積為100 μl，且人相關抗體的使用量較多，所以溶劑FACS buffer的體積需要減去各個抗體的使用體積。且所有的抗體需要避光操作，避免熒光猝滅；抗體開蓋之前需要先離心避免管壁上的抗體飛濺引起浪費；抗體不易長時間在室溫放置，建議置于冰上使用。
2. 取1 x 106個外周血免疫細胞，用抗體混合物重懸細胞，置于96孔板中，充分混勻后4 °C避光孵育30 min。
3. 染色結束后，直接加入150 μl FACS buffer清洗細胞，400 x g，5 min室溫離心。
4. 離心結束后去上清，用300 μl FACS buffer分兩次重懸細胞沉淀，再將細胞通過70 μm濾膜過濾到流式管中，即可上機觀察。
5. 在表面染色的過程中，我們需要制作25色染色方案的單染管用于流式自動調節補償。取26個流式管，分別標上各個通道的熒光名稱，第26個為空白管，每個流式管中加入兩滴Ms Ig Kpa Comp Bead (約有50 μl的體積)，混勻后，對應管壁上標注的熒光通道加入之前染色使用的表面抗體各0.25 μl，1:200稀釋。充分振蕩混勻后4 °C避光孵育15 min，各加入400 μl FACS buffer，混勻后即可用于流式分析。
6. 注：Ms Ig Kpa Comp Bead使用前需要充分搖勻。
7. 
   三． 25色全景分析 (van der Maaten和Hinton，2008；Wallach和Liliean，2009；Monaco等，2016)

得到流式結果后，需要使用正版flowjo V10軟件對結果進行全面分析在flowjo V10中導入數據后，我們需要對25色補償進行手動調整。主要是因為小球調整的補償和細胞真實的補償存在一定的差異，所以還需要手動確認去除原始數據中由于液流不穩定等機器原因導致的噪音信號。主要使用plugin插件中的flow AI得以實現 注：使用flow AI選擇參數時，必須選中time參數，不然將無法計算相關參數。運行結束后，我們將看到原始數據拆分成了bad events和good events兩項。之后我們可以對good events進行常規的圈門統計分析正版flowjo包含了很多實用性的插件：t-SNE，SPADE，FlowSOM，Phenograph，UMAP等等。其中本實驗主要運用了t-SNE這個算法對25色結果進行全景分析。t-SNE主要對多參數的數據進行降維分析，通過定義納入分析的參數通道，算法可將細胞分成不同距離遠近的點，距離越遠代表細胞相似度越低。我們在圈出的淋巴細胞的基礎上，先downsample出7萬個淋巴細胞，針對這7萬個細胞，我們選中除FSC、SSC相關參數以外的所有補償后的熒光參數 (一共25個通道參數)，進行t-SNE分析

1. 分析結束后，結合傳統的淋巴細胞亞群定義 (即結果圖7中的圈門方法)，我們在layout界面將這幾群細胞以t-SNE1和t-SNE2為橫縱坐標的點圖merge在一起并導出，結束分析。

結果與分析

本實驗先根據細胞大小和包含的顆粒度，即FSC和SSC，將人外周血免疫細胞主要分成淋巴細胞群和單核細胞群等。然后，我們觀察了CD3、CD19的表達情況，其中CD3+為T細胞群，占白細胞64.6%，CD19+為B細胞群，占白細胞8.45%。細分T細胞，通過CD4和CD8，可以將T細胞分為輔助T細胞和殺傷性T細胞，兩者分別占T細胞的64%和30%。對于輔助T細胞，我們還檢測了其中一個亞群Treg的比例，其約占輔助T細胞的7.85%。CD3+CD56+的細胞群為NKT細胞，大約占T細胞的5.72%。細分B細胞，IgD+的naïve B細胞約占總B細胞的52.1%，CD27+的記憶B細胞約占總B細胞的27%。根據文獻報道的不同免疫細胞亞群的定義，在本次實驗中主要劃分了T細胞 (CD3+)、B細胞 (CD19+)、NKT細胞 (CD3+CD56+)、NK細胞(CD3-CD19-CD16+CD56+)、DC(CD3-CD19-CD56-HLA DR+)、單核細胞(CD3-CD19-CD14+)等不同免疫細胞亞群。D3-CD19-的雙陰性細胞群既包含淋巴細胞群又包含單核細胞群。因此根據CD14的表達情況和細胞內顆粒度 (SSC)，可將細胞群劃分為CD14+單核細胞群和CD14-淋巴細胞群。細分CD14-CD3-CD19-淋巴細胞群，其中CD56+為NK細胞，約有84.9%的細胞高表達CD94，用于識別MHC I。而CD56-為DC細胞群，其中約有52.3%表達HLA-DR。存在的問題是，本次實驗關于單核細胞群的分類并不明顯，猜測是本次樣品粒細胞群不明顯的問題。通過25色大panel，我們可以大程度一次性觀察所有人外周血免疫細胞亞群并得到相應的細胞比例。取7萬個免疫細胞進行t-SNE分析，分析參數為補償后的25個maker。A. 流式圈門后的不同細胞群顯示t-SNE界面并合并在一起得到細胞群降維后的分布形態。B. 在t-SNE分布圖上根據每個細胞CD45RA的表達情況 (即平均熒光強度) 做的熱圖，紅色代表CD45RA表達高，藍色代表表達低。t-SNE全稱t-distributed stochastic neighbor embedding，可將多維參數經迭代計算后在二維坐標軸上進行展示。通過計算，t-SNE分布圖由多個散點組成，每個散點代表一個細胞，兩個散點之間的距離代表著兩個細胞的相似程度。距離越近，則相似程度越高。另外，在正版flowjo V10版本中，還可以觀察t-SNE heatmap，即在t-SNE坐標軸中展示某一個參數的表達水平。在圖8A中，明顯的比例高的紅色細胞群為輔助T細胞，粉色的Treg細胞群位于其中，這與Treg屬于輔助T細胞這一常識相一致，說明本次t-SNE分析可信。由于NKT細胞表達CD4或CD8，因此一部分NKT亞群靠近輔助T細胞，一部分NKT靠近殺傷性T細胞，因而紫色的NKT細胞表現出很高的異質性。因為t-SNE是綜合25個參數進行的分析，所以我們可以發現不同淋巴細胞內部的異質性。圖8B中T細胞的異質性主要體現在CD45RA的表達上，由于不同的T細胞關于CD45RA的表達不一致，從而出現明顯的亞群分類。另外，加入其它有意義的maker，有助于發現新的細胞亞群。

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