病毒的流式檢測

                         Flow Cytometric Analysis of Virus

摘要：流式細胞術 (FCM) 可通過分析受感染細胞來間接檢測病毒或其抗原，然而該方法存在測量過程繁瑣、耗時長、誤差大等缺點。伴隨FCM的不斷發展，其檢測范圍已不再局限于細胞，目前已可利用流式細胞儀直接分析各類形態和基因組大小各異 (直徑范圍：100~200 nm) 的病毒，如桿狀病毒、帶狀皰疹病毒、HIV-1病毒等。跟病毒的其他檢測方法相比，FCM法具有重復性好、簡便快速、可獲取多參數信息等優勢。除此之外，FCM得到的熒光分布結果還可進一步用于病毒蛋白合成及病毒顆粒釋放等數據的統計估算和數學建模。本文以含有GFP熒光蛋白的HIV慢病毒為例，簡要介紹一種利用FCM對其進行檢測的方法。

關鍵詞: 流式細胞儀, GFP熒光蛋白, HIV慢病毒, 檢測

       材料與試劑

1. 過濾器
2. 慢病毒包裝系統 (GeneCopoeia, catalog number: HPK-LvTR-20)
3. 聚苯乙烯綠色熒光微球 (Invitrogen, catalog number: F13839)
4. HEK293 T細胞 (ATCC)
5. 超純水 (Milli-Q水)
6. Opti-MEM培養基 (Gibco, catalog number: 51985091)
7. 多聚甲醛 (Sigma-Aldrich, catalog number: 16005-1KG-R)
8. 磷酸鈣
9. 20%蔗糖溶液
10. p24 ELISA試劑盒
11. KH2PO4
12. Na2HPO4
13. NaCl
14. KCl
15. 鹽酸
16. 磷酸緩沖液 (1× PBS) (見溶液配方)

        儀器設備

1. 超速離心機 (Beckman, model: Optima XPN-100)
2. 流式細胞儀 (BD, model: FACSAria SORP)

        軟件

1. FlowJo v10.0.8軟件

   實驗步驟

   一、慢病毒的制備

2. 構建HIV核心基因片段質粒 (野生型或帶有iGFP熒光標簽)，使用磷酸鈣作為轉染試劑，兩者混合均勻后，繼續靜置15 min。
3. HEK293 T細胞種植于直徑為10 cm的培養皿中，孵育過夜后換用新鮮培養基，并將上述混合液加入培養基中，放回培養箱中繼續培養。
4. 在培養72 h后，將培養瓶中的培養基 (病毒液) 收集起來，1,500 × g離心30 min，棄去細胞碎片。
5. 上清液用0.22 μm的濾頭過濾，在20%的蔗糖溶液中離心濃縮病毒 (100,000 × g，2 h)。
6. 用適量超純水重懸病毒，得到慢病毒的濃縮液，經p24 ELISA試劑盒確定病毒濃度。病毒經2%的多聚甲醛固定后直接上機檢測。

   二、流式細胞術檢測慢病毒

   流式細胞儀的參數設置：建立雙參數FSC/SSC散點圖和EGPF/SSC雙參數散點圖，根據其信號調節光電倍增管電壓，得到合適的流式圖。流式細胞儀選用70 µm的噴嘴，設前向角 (FSC) 電壓值為10 V，側向角 (SSC) 為250 V，熒光通道PMT電壓調整至合適值，確保經0.1 μm濾頭過濾后的PBS緩沖液上樣后，在低流速度下的顆粒數< 10 events/s。在雙參數 FSC/SSC或者EGPF/SSC散點圖中找到病毒集中的區域設門，圈出所需要分析的病毒，并用FlowJo v10.0.8軟件進行數據分析。

   結果與分析

   常用的病毒載體有腺病毒、逆轉錄病毒和慢病毒。逆轉錄病毒載體只能感染分裂期細胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色體上，只能進行瞬時感染。與其他逆轉錄病毒相比，慢病毒具有可以感染非分裂期細胞、容納外源性基因片段大、可以長期表達等顯著優點。慢病毒不產生任何有效的細胞免疫應答，可作為一種體外基因運輸的工具。慢病毒載體介導的轉基因表達能持續數月，且無可觀察到的病理學現象。因此，慢病毒載體在基因轉染中的應用極為廣泛，本文以其為例，通過FCM分析其熒光標記效率。

   在正式檢測病毒之前，我們首先利用流式分析儀檢測不同尺寸的商品化聚苯乙烯綠色熒光微球，以此驗證流式細胞儀對微納米尺度的顆粒的分析性能 (Vlasak等，2016；Bonar和Tilton，2017)。結果如圖1所示，我們選用的流式細胞儀對200 nm以上的微顆粒具備分辨能力。

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8. 圖1. 流式細胞儀通過FSC和SSC分析不同尺寸的熒光微球獲得的散點圖
   
   慢病毒尺寸在120至150 nm范圍內，因此傳統基于FSC和SSC獲取散點的辦法并不適用。但是我們發現，當HIV慢病毒顆粒帶有GPF熒光標簽后，利用熒光強度代替FSC作為閾值篩選條件，可以將病毒區分開來。如圖2所示，標記有GFP的病毒可以出現明顯的散點群落，而未標記的野生型并未出現。

9.  

   

   圖2. 流式細胞儀GFP熒光通道和SSC分析野生型和GFP標記的HIV慢病毒獲得的散點圖

   失敗經驗

10. 檢測病毒樣本前還需要使用空白對照，由TE溶液和經0.22 μm濾器或30-kDa超濾管過濾的樣本按病毒溶液同樣稀釋度配制。只有當空白對照的陽性數量及熒光背景很低時才能進行樣本檢測。

11. 在分析單病毒過程中，需要排除病毒間的粘連，因此在制備病毒液過程中要首先通過分速離心的辦法去除細胞碎片，再先后使用0.45 μm和0.22 μm的濾器過濾掉其他雜質。
12. 實驗中，為排除雜質及噪音信號的影響，使用的耗材一定要潔凈，緩沖液一定要經0.04 μm濾器過濾，儀器的氣路和液路盡量分別裝上0.01 μm的空氣過濾器和0.04 μm的鞘液過濾器。

    溶液配方

13. 磷酸緩沖液 (1× PBS)
    0.24 g磷酸二氫鉀 (KH2PO4)
    1.44 g磷酸氫二鈉 (Na2HPO4)
    8 g氯化鈉 (NaCl)
    0.2 g 氯化jia(KCl)
    加去離子水約0.8 L充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調pH至7.4，后定容到1 L

    致謝

    本文實驗方案改編自美國凱斯西儲大學 Micha? M. Bonar, John C. Tilton于2017年發表在Virology雜志上的文章 (Bonar和Tilton, 2017)。

    參考文獻

14. Bonar, M. M. and Tilton, J. C. (2017). High sensitivity detection and sorting of infectious human immunode?ciency virus (HIV-1) particles by ?ow virometry. Virology 505: 80-90.
15. Vlasak, J., Hoang V. M., Christanti, S., Peluso, R., Li, F. and Culp T. D. (2016). Use of ?ow cytometry for characterization of human cytomegalovirus vaccine particles. Vaccine 34(20): 2321-2328.

    Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.

    引用格式：閔娟, 關武祥. (2019). 病毒的流式檢測. Bio-101: e1010318. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010318.
    How to cite: Min, J. and Guan, W. X.  (2019). Flow Cytometric Analysis of Virus. Bio-101: e1010318. DOI:10.21769/BioProtoc.1010318.