農桿菌感受態細胞的制備

［實驗原理］

在利用根癌農桿菌介導的基因轉化中，首先要獲得含有目的基因的農桿菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受態細胞的制備和質粒的轉化是一項基本技術。感受態是細菌細

胞具有的能夠接受外源 DNA 的一種特殊生理狀態。農桿菌的感受態可用 CaCl2 處理而誘導

產生。將正在生長的農桿菌細胞加入到低滲的 CaCl2 溶液中，0℃下處理便會使細菌細胞膜

的透性發生改變，此時的細胞呈現出感受態。制備好的農桿菌感受態細胞迅速冷凍于-70℃

可保存相當一段時間而不會對其轉化效率有太大的影響。

［實驗儀器、材料和試劑］

一、儀器：超凈工作臺，恒溫搖床，冷凍高速離心機，高壓滅菌鍋，冰箱，-70℃超低

溫冰柜，分光光度計，接種針，10ml 試管，50ml 離心管，1.5ml 離心管，冰浴，

微量進樣器及吸頭。

以上玻璃儀器和離心管需在用前滅菌，滅菌條件：120℃，15 分鐘。

二、材料：土壤農桿菌 LBA4404 菌株或其它農桿菌菌株

三、試劑：YEB 液體培養基（1L）：酵母提取物 1g，牛肉gao 5g，蛋白胨 5g，蔗糖 5g，

MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高壓滅菌。

利福平（Rif）儲液：50mg/ml

20mM CaCl2，高壓滅菌。

［實驗步驟］

1、挑取根癌農桿菌 LBA4404 單菌落于 3ml 的 YEB 液體培養基（含 Rif 50mg/l）

中，28℃振蕩培養過夜；2、取過夜培養菌液 1ml 接種于 50mlYEB（Rif 50mg/l）液體培養基中，28℃振蕩

培養至 OD600 為 0.5；

3、取 2ml 菌液，13000rpm，離心 30sec, 棄上清；

4、加入 1000µl 20mM CaCl2，使農桿菌細胞充分懸浮，冰浴 30min；

5、13000rpm，離心 30sec，棄上清，置于冰上，加入 500µl 預冷的 20mM CaCl2，

充分懸浮細胞，冰浴中保存，24hr 內使用，或液氮中速凍 1min，置-70℃保存備用。

質粒 DNA 直接導入農桿菌

［實驗原理］

在低溫下，外源 DNA（質粒）可吸附到感受態細胞表面，誘導細胞吸收 DNA。（加

入熱激原理）轉化了質粒 DNA 的農桿菌隨后 28℃恢復培養，可使質粒上攜帶的編碼抗生

素的抗性基因得到表達，因此，轉化了質粒的農桿菌細胞可在含有相應抗生素的培養基上生

長，而沒有轉化的細胞則無法生長。

［實驗儀器、材料和試劑］

一、儀器：超凈工作臺，恒溫搖床，培養箱，臺式離心機，水浴鍋，高壓滅菌鍋，-70℃

超低溫冰箱，培養皿，微量進樣器及吸頭。

材料：根癌農桿菌 LBA4404（或 EHA105）感受態細胞，質粒 pCAMBAI1300+SPR 植物

表達載體

二、試劑：液氮

YEB 液體培養基（1L）：酵母提取物 1g，牛肉gao 5g，蛋白胨 5g，蔗糖 5g，MgSO4

•7H2O 0.5g，pH7.0，高壓滅菌。

YEB 固體培養基：每升 YEB 液體培養基加 15g 瓊脂粉，高壓滅菌?？敲顾兀↘an）儲液：50mg/ml

利福平（Rif）儲液：50mg/ml

YEB 固體培養基平板（Kan 抗性）：滅菌后的 YEB 固體培養基待其溫度降至 50℃時加

入卡那霉素（Kan）和利福平（Rif），至終濃度分別為 100µg/ml 和 50µg/ml，混勻后立

即倒入培養皿，凝固后 4℃倒置保存。

［實驗步驟］

1、在 200µl 感受態細胞中加入 2－6µl 質粒（pBI121）DNA，冰浴 5min，液氮中速

凍 5min；

2、迅速轉入 37℃水浴中，熱激 5min；

3、加入 1ml YEB 液體培養基，28℃慢速振蕩培養 2－4 小時；

4、3000rpm 離心 4min，去一部分上清，留取 200µl 菌液涂布于含有 50µg/ml Kan

和 50µg/ml Rif 的 YEB 平板；

5、放置約 0.5h，待水份干后，28℃培養約 24 小時至長出菌落。

農桿菌轉化子的鑒定

［實驗原理］

經改造的 Ti 質粒（只含有幫助 T-DNA 跳到植物染色體上的 Vir 區）存在于農桿菌工程

菌株中，含有 T-DNA 的雙元載體（Binory Vectors）完成重組后可以在大腸桿菌中擴增，

再轉入農桿菌中。從抗性培養基上篩選得到的農桿菌轉化子中應攜帶轉入的重組質粒，而對

照菌株則沒有。

堿裂解法是一種應用zuiwei廣泛的質粒 DNA 提取方法，該法用于從小量培養物中抽提質

粒 DNA，比較方便、省時，提取的 DNA 質量較高，可用于 DNA 的酶切、PCR 甚至測序。

提取質粒 DNA 是基于染色體 DNA 與質粒 DNA 的變性與復性的差異而使其分離。當細胞在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解時，在 pH 高達 12.6 的堿性條件下，蛋白質和染色體 DNA

發生變性，染色體 DNA 的氫鍵斷裂、雙螺旋結構解開，而質粒 DNA 雖大部分氫鍵也斷裂，

但超螺旋共價閉合環狀結構的兩條互補鏈不會完全分離，當加入中和液醋酸鉀或醋酸鈉高鹽

緩沖液時，質粒 DNA 恢復原來的構型，而染色體 DNA 不能復性，形成纏繞的網狀結構，

通過離心，染色體 DNA、蛋白質-SDS 復合物隨細胞碎片等沉淀下來，質粒 DNA 則留在上

清中。

［實驗儀器、材料和試劑］

一、儀器：臺式高速離心機，高壓滅菌鍋，恒溫搖床，恒溫水浴，電泳儀及電泳槽，紫

外燈，加樣器（pipettor），小離心管（eppendorf tube），吸頭（tip），三角瓶，

牙簽。

二、材料：含質粒的農桿菌 LBA4404（或 EHA105），農桿菌 LBA4404 或 EHA105）

三、試劑：YEB 液體培養基（1L）：酵母提取物 1g，牛肉gao 5g，蛋白胨 5g，蔗糖 5g，

MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高壓滅菌。

溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖

25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）

10mmol/L EDTA（pH8.0），高壓滅菌（6.895×104Pa），4℃保存

溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH ，1％ SDS

先分別配成濃度 0.4M NaOH（滅菌）及 2％ SDS，用前等體積混合。

溶液Ⅲ：3mol/L NaAc/KAc（pH4.8）10

5mol/L NaAc/KAc 60ml（滅菌）

HAc 11.5ml

H2O 28.5ml（滅菌），三者混合 EB：貯液濃度為 10mg/mL，工作濃度為 0.5µg/ml

TAE：40mmol/L Tris-HAc，2mmol/L EDTA，pH8.0，Tris 飽和酚、氯fang、無

水乙醇、RNase A

［實驗步驟］

1、質粒 DNA 的提取

（1）挑取一個單菌落接種于 3ml 含相應抗生素的 YEB（50mg/L Km）液體培養基中，

28℃劇烈振蕩過夜；

（2）收集 1.5ml 過夜培養物于 1.5ml 離心管中，10000rpm 離心 30sec 收集菌體，盡

可能除盡培養基；

（3）向細胞沉淀中加入 100µl 預冷的溶液Ⅰ，劇烈振蕩，使菌體充分懸??；

（4）加入 200μl 溶液Ⅱ，立即溫和顛倒離心管 4-10 次，避免劇烈振蕩；

（5）加入 150μl 溶液Ⅲ，溫和顛倒離心管 4-10 次，將離心管置冰浴 5min；

（6）于室溫 12000g 離心 15min，將上清液轉入新的離心管中（盡量避免吸取沉淀）；

（7）加入 0.6 倍體積的異丙醇，顛倒混勻；

（8）12000g 離心 10min，棄上清液，加入 400μl 70%乙醇，12000g 離心 8min，

棄上清，在真空抽干或在超凈工作臺中吹干；

（9）加入 10µl 含 20µg/ml RNase A 的 TE 或重蒸水溶解 DNA，37°C 溫育 30min；

（10）-20℃保存。

2、用瓊脂糖電泳檢測質粒 DNA（或用 PCR 進行檢測）

用 1×TAE 配制 0.8％的瓊脂糖凝膠，取所提取的質粒 DNA 溶液 2-5µl 進行電泳，

50-100v 約 0.5-1hr，紫外燈下觀察結果。煙草遺傳轉化實驗

[實驗器材]

搖床、超凈工作臺、冰箱、移液搶、鑷子、手術刀、打孔器、酒精燈、棉球、培養皿、

三角瓶、濾紙、牛皮紙、牙簽。

[實驗藥品]

MS 培養基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、瓊脂、蔗糖、卡那霉素、羧卞青霉素、

無菌水、6-BA、NAA、0.1%升gong、70%乙醇。

煙草愈傷誘導或分化培養基：MS＋6-BA(1.0 mg/L )+NAA(1.0mg/L)

煙草生根培養基：MS+ NAA(0.1mg/L)

煙草選擇培養基：MS＋6-BA(1.0 mg/L )+NAA(1.0mg/L)+75mg/L Km+500mg/L

羧卞青霉素（Cb）

[實驗步驟]

1.受體材料的準備與預培養

（1）取自田間栽培煙草植株，用蒸餾水沖洗 1 遍后，以 70%乙醇清洗 45s，再以 0.1%

的升gong消毒 6-8min，無菌水沖洗 5 遍，無菌濾紙吸干水分。

（2）用滅過菌的打孔器將無菌煙草葉片鑿成 6mm 的葉盤（或用手術刀切成 5－10mm

方形葉片。

（3）將葉盤或葉片接種在煙草愈傷組織誘導或分化培養基上進行預培養，預培養 2－3

天，材料切口處剛剛開始彭大時備用。

2.根癌農桿菌培養

（1）從平板上挑取單菌落，接種到 20mL 附加相應抗生素（卡那霉素）的 YEB 液體培養

基中，在恒溫搖床上，于 28℃下以 180r/min 培養至 OD600 為 0.6~0.8（約需 17h）。

（2）OD600 為 0.6~0.8 的菌液，按 1%~2%的比例，轉入新配制的無抗生素的 YEB 液體

培養基中，可同時加入 100~500µmol/L 的乙酰丁香酮。在上述相同的條件下再培養 6h 左

右，待 OD600 為 0.2~0.5 時即可用于轉化。

3.浸染在超凈工作臺上，將菌液倒入無菌三角瓶中，從培養瓶中取出預培養過的外植體，放入

菌液中，浸泡適當時間（5~30min）。取出外植體置于無菌濾紙上吸去附著的菌液。

4.共培養

將浸染過的外植體接種在煙草愈傷組織誘導或分化培養基上，在 28℃暗培養條件下共

培養 2~4 天。

5.選擇培養

將經過共培養的外植體移到加有選擇壓的煙草愈傷組織誘導或分化培養基（附加

500mg/L 的羧芐青霉素，抑制根癌農標菌生長）上，在光照為 2000~10000lx、25℃條件

下進行選擇培養。

6.繼代選擇培養

選擇培養 2－3 周后，外植體的轉化細胞將分化出抗性不定芽或產生抗性愈傷組織，將

這些抗性材料轉入相相應的選擇培養基中進行繼代擴繁培養，或轉入附加選擇壓的生長或分

化培養基中使其生長或誘導生化。

7.生根培養

待不定芽長到 1cm 以上時，切下并插入含有選擇壓的煙草生根培養基上進行生根培養，

兩周左右長出不定根。

附 YEP 可用 LB 培養基替代，配方如下：

LB 固體培養基和 LB 液體培養基

酵母提取物(yeast Ext) 5g/L

蛋白凍(peptone) 10g/L

NaCl 10g/L液體 LB 培養基不含瓊脂，供搖床培養農桿菌，含 0.5%瓊脂的固體供短期保存菌種用。

(pH7.0-7.2)