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    細胞凋亡檢測,細胞凋亡實驗步驟,檢測方法

    發布時間:2020-03-13瀏覽:1365次

    細胞凋亡檢測,細胞凋亡實驗步驟,檢測方法

    一、 定性和定量研究

    只定性的研究方法:常規瓊脂糖凝膠電泳、脈沖場倒轉瓊脂糖凝膠電泳、形態學觀察(普通

    光學顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡)

    進行定量或半定量的研究方法:各種流式細胞儀方法、原位末端標記法、ELISA 定量瓊脂糖

    凝膠電泳。

    二、區分凋亡和壞死

    可將二者區分開的方法:瓊脂糖凝膠電泳,形態學觀察(透射電鏡是是區分凋亡和壞死可

    靠的方法),Hoechst33342/PI 雙染色法流式細胞儀檢測,AnnexinV/PI 雙染色法流式細

    胞儀檢測等。

    不能將二者區分開的方法:原位末端標記法、PI 單染色法流式細胞儀檢測等。

    三、樣品來源不同選擇

    組織:主要用形態學方法(HE 染色,透射電鏡、石蠟包埋組織切片進行原位末端標記,ELISA

    或將組織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電泳)。

    四、細胞凋亡檢測

    1、 早期檢測:

    1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測

    2)細胞內氧化還原狀態改變的檢測3)細胞色素 C 的定位檢測

    4) 線粒體膜電位變化的檢測

    2、 晚期檢測:

    細胞凋亡晚期中,核酸內切酶在核小體之間剪切核 DNA,產生大量長度在 180-200 bp 的

    DNA 的片段。

    對于晚期檢測通常有以下方法:

    1) TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的 dUTP 缺口末端標記)

    2) LM-PCR Ladder (連接介導的 PCR 檢測)

    3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)

    3、生化檢測:

    1)典型的生化特征:DNA 的片段化

    2)檢測方法主要有:瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標記(TUNEL)等

    3)TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的 dUTP 缺口末端標記)

    4)通過 DNA 末端轉移酶將帶標記的 dNTP (多為 dUTP)間接或直接接到 DNA 的片段的

    3’-OH 端,再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果??勺黾毎麘襶e、福爾馬林固定或石

    蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。

    4、LM-PCR Ladder (連接介導的 PCR 檢測)

    當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少(如活體組織切片)時,直接瓊脂糖電泳可能觀察

    不到核 DNA 的變化。通過 LM-PCR,連上特異性接頭,專一性地擴增梯度片段,從而靈敏

    地檢測凋亡時產生梯度片段。此外,LM-PCR 檢測是半定量的,因此相同凋亡程度的不同

    樣品可進行比較。如果細胞量很少,還可在分離提純 DNA 后,用 32P-ATP 和脫氧核糖核

    苷酸末端轉移酶(TdT)使 DNA 標記,然后進行電泳和放射自顯影,觀察凋亡細胞中 DNA ladder 的形成。

    上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核 DNA 斷裂這一特征,但細胞受到其它損傷(如機械損

    傷,紫外線等)也會產生這一現象,因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。需結

    合其它的方法來檢測細胞凋亡。

    其它方法:

    1)Telemerase Detection (端粒酶檢測)

    端粒酶是由 RNA 和蛋白組成,它可以自身 RNA 為模板逆轉錄合成端粒區重復序列,使細

    胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的,每分裂一次,染色體的端粒會縮短,

    這可能作為有絲分裂的一種時鐘,表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發現,

    90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。

    2)mRNA 水平的檢測

    研究者們發現了很多在細胞凋亡時表達異常的基因,檢測這些特異基因的表達水平也成為檢

    測細胞凋亡的一種常用方法。據報道,Fas 蛋白結合受體后能誘導癌細胞中的細胞毒性 T

    細胞(cytotoxic T cells)等靶細胞。Bcl-2 和 bcl-X (長的) 作為抗凋亡(bcl-2 和 bcl-X)

    的調節物,它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。用熒光定量 PCR 技術來檢測

    基因表達水平無疑比之前者更快更準確。通過檢測 fas, bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的

    mRNA 表達水平來進行細胞凋亡的檢測。

    5、細胞內氧化還原狀態改變的檢測:

    正常狀態下,谷光苷肽(GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通

    過被 GSH 還原而定期去除,氧化型的 GSH 又可被 GSH 還原酶迅速還原。這一反應在線粒

    體中尤為重要,許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。當細胞內 GSH 的排除非

    ?;钴S時,細胞ye就由還原環境轉為氧化環境,這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低,從而使細胞色素 C(三羧酸循環中的重要組分)從線粒體內轉移到細胞ye中,啟動凋

    亡效應器 caspase 的級聯反應。

    6、細胞色素 C 的定位檢測

    細胞色素 C 作為一種信號物質,在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下,它存在于

    線粒體內膜和外膜之間的腔中,凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞漿,結合 Apaf-1

    (apoptotic protease activating factor-1)后啟動 caspase 級聯反應:細胞色素 C/Apaf-1

    復合物激活 caspase-9,后者再激活 caspase-3 和其它下游 caspase。

    7、線粒體膜電位變化的檢測:

    1)線粒體跨膜電位的耗散與細胞凋亡有密切關系

    2)近年來陸續有報道說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活,也早于磷酯酰絲氨酸

    暴露于細胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散,細胞就會進入不可逆的凋亡過程。

    3)在細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內膜的通透性轉變,這是由

    于生成了動態的由多個蛋白質組成的位于線粒體內膜與外膜接觸位點的通透性轉變孔道(PT

    孔道)能穩定線粒體跨膜電位就能防止細胞凋亡。

    線粒體在細胞凋亡作用中的進一步證據:

    1)若將純化的正常的線粒體與純化的細胞核在一起保溫,并不導致細胞核的變化。但若將

    誘導生成 PT 孔道的線粒體與純化的細胞核一同保溫,細胞核即開始凋亡變化。

    2)形態學觀察,看到細胞數目有限,統計學上的準確性受影響;

    3)凝膠電泳檢測 DNA 破壞了細胞的完整性也不能測出凋亡細胞占總細胞的比例;

    4)流式細胞術可檢測細胞、亞細胞及分子水平的特征性變化。

    用于流式細胞儀檢測的染料:

    PI、Hoechst、 EB、 DAPI、丫啶橙等,其中 PI、Hoechst zui常用。PI 和 Hoechst33342 雙標:

    PI、Hoechst33342 均可與細胞核 DNA(或 RNA)結合。但是 PI 不能通過正常的細胞膜,

    Hoechst 則為膜通透性的熒光染料,故細胞在處于壞死或晚期調亡時細胞膜被破壞,這時

    可為 PI 著紅色。正常細胞和中早期調亡細胞均可被 Hoechst 著色,但是正常細胞核的

    Hoechst 著色的形態呈圓形,淡蘭色,內有較深的蘭色顆粒;而調亡細胞的核由于濃集而

    呈亮蘭色,或核呈分葉,碎片狀,邊集。

    故 PI 著色為壞死細胞;亮蘭色,或核呈分葉狀,邊集的 Hoechst 著色的為調亡細胞。

    PI 和 Annexin-V 雙標:

    磷脂酰絲氨酸(PS)正常位于細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期(或細胞損傷時)PS 可

    從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環境中。

    Annexin-V(green)可以和磷脂酰絲氨酸(PS)特異性結合。因此細胞處于調亡或壞死時,

    Annexin-V 可為陽性(早期的壞死細胞可能為陰性)。但是只有壞死的細胞 PI 是陽性

    五、形態學觀察

    1、普通光學顯微鏡觀察

    2、透射電子顯微鏡觀察

    3、熒光顯微鏡觀察

    1、普通光鏡下觀察:

    1)用蘇木素-伊紅(HE)染色:細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色(凋亡細胞),

    正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色,壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失

    2)Giemsa 染色法、瑞氏染色法等,正常細胞核的色澤均一,凋亡細胞染色變深,壞死細胞

    染色淺或沒染上顏色直接用倒置顯微鏡觀察:

    1)細胞體積變小,全面皺縮;

    2)凋亡小體為數個圓形小體圍繞在細胞周圍。

    2、透射電子顯微鏡觀察

    凋亡細胞體積變小,細胞質濃縮。

    細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期:Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣,

    部分染色質出現濃縮狀態;Ⅱa 期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;Ⅱb 期的細胞核裂解

    為碎塊,產生凋亡小體。

    3、熒光顯微鏡

    常用的熒光染料:丫啶橙、 PI 、DAPI、Hoechst33258 和 Hoechst33342、EB 等

    Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI 三種染料與 DNA 的結合是非嵌入式的,主要

    結合在 DNA 的 A-T 堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。

    1)PI 雙染色法基本原理

    Hoechst 是與 DNA 特異結合的活性染料,能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作

    用。Hoechst 33342 在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。

    DAPI 為半通透性,用于常規固定細胞的染色。

    碘化丙啶(PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,

    PI 能夠透過細胞膜而將細胞核染紅。因此將 Annexin-V 與 PI 匹配使用,就可以將凋亡早

    晚期的細胞以及死細胞區分開來。

    注意事項:細胞凋亡時,其 DNA 可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一,但這種 DNA

    可染性降低也可能是因為 DNA 含量的降低,或者是因為 DNA 結構的改變使其與染料結合

    的能力發生改變所致。在分析結果時應該注意。六、細胞凋亡的分子生物學檢測方法:

    細胞凋亡中染色體 DNA 的斷裂是個漸進的分階段的過程,染色體 DNA 首先在內源性的核

    酸水解酶的作用下降解為 50-300kb 的大片段。然后大約 30 ﹪的染色體 DNA 在 Ca ²+和

    Mg²+依賴的核酸內切酶作用下,在核小體單位之間被隨機切斷,形成 180~200bp 核小

    體 DNA 多聚體。DNA 雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列 DNA 的 3’-OH

    末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧

    化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到 DNA 的 3’-末端,從而可進行凋亡細

    胞的檢測,這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)。

    由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA 的斷裂,因而沒有 3’-OH 形成,很少能夠被

    染色。低分子量的 DNA 分離后,也可使用 DNA 聚合酶進行缺口翻譯(nick translation),

    使低分子量的 DNA 標記或染色,然后分析凋亡細胞。TUNEL 或缺口翻譯法實際上是分子

    生物學與形態學相結合的研究方法,對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能

    準確的反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征,可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切

    片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定,并可檢測出極少量的凋亡細胞,靈

    敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高,因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

    過氧化物酶標記測定法

    原理:脫氧核糖核苷酸衍生物地gao辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在 TdT 酶的作用下,可

    以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈 DNA 的 3-OH 末端,與 dATP 形成異多聚體,并可與連接了

    報告酶(過氧化物酶或堿性磷酸酶)的抗地gao辛抗體結合。在適合底物存在下,過氧化物酶

    可產生很強的顏色反應,特異準確的定位出正在凋亡的細胞,因而可在普通光學顯微鏡下進

    行觀察。毛地黃植物是地gao辛的唯1來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地gao辛杭體結合的配

    體,因而非特異性反應很低??沟豨ao辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到

    1%,若此抗體的 Fc 部分通過蛋白酶水解的方法除去后,則可完全排除細胞 Fc 受體非特異

    性的吸附作用。

    本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養的或從組織中分離的

    細胞凋亡測定。

    (一)試劑配制

    1、磷酸緩沖ye PBS(pH7.4):磷酸鈉鹽 50mM,NaCl 200mM。

    2、蛋白酶 K(200μg/ml,pH7.4):蛋白酶 K 0.02g;PBS 100ml。

    3、含 2%H2O2 的 PBS 緩沖ye(pH7.4):H2O2 2.0ml;PBS 緩沖ye 98.0ml。

    4、TdT 酶緩沖ye(新鮮配):Trlzma 堿 3.63g 用 0.1N HCl 調節 pH 至 7.2,加 ddH2O

    定容到 1000ml;再加入二甲砷suan鈉 29.96g 和氯化鈷 0.238g。

    5、TdT 酶反應ye:TdT 酶 32μl;TdT 酶緩沖ye 76μl,混勻,置于冰上備用。

    6、洗滌與終止反應緩沖ye:氯化鈉 17. 4g;檸檬酸鈉 8.82g;ddH2O 1000ml

    7、0.05%二氨基聯苯(DAB)溶ye:DAB 5mg;PBS 10ml,pH7.4, 臨用前過濾后,加

    過氧化氫至 0.02%。

    8、0.5%甲基綠(pH4.0):甲基綠 0.5g;0.1M 乙酸鈉 100ml。

    9、100%丁醇,100%、95%、90%、80%和 70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶ye,

    乙酸,松香水等。

    10、 過氧化物酶標記的抗地gao辛抗體(ONCOR)

    (二)實驗步驟

    1、標本預處理:(1)石蠟包埋的組織切片預處理:將組織切片置于染色缸中,用二甲苯洗兩次,每次 5min。

    用無水乙醇洗兩次,每次 3min。用 95%和 75%乙醇各洗一次,每次 3min。用 PBS 洗 5min

    加入蛋白酶 K 溶ye(20ug/ml),于室溫水解 15min,去除組織蛋白。用蒸餾水洗 4 次,

    每次 2min,然后按下述步驟 2 進行操作。

    (2)冰凍組織切片預處理:將冰凍組織切片置 10%中性甲醛中,于室溫固定 10min 后,

    去除多余ye體。用 PBS 洗兩次,每次 5min。置乙醇:乙酸(2:1)的溶ye中,于-20℃處

    理 5min,去除多余ye體。用 PBS 洗兩次,每次 5min,然后按下述步驟 2 進行操作。

    (3)培養的或從組織分離的細胞的預處理:將約 5 × 107 個/ml 細胞于 4%中性甲醛室溫

    中固定 10min。在載玻片上滴加 50~100μl 細胞懸ye并使之干燥。用 PBS 洗兩次,每次

    5min,然后按下述步驟 2 進行操作。

    2、色缸中加入含 2%過氧化氫的 PBS,于室溫反應 5min。用 PBS 洗兩次,每次 5min。

    3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余ye體,立即在切片上加 2 滴 TdT 酶緩沖ye,

    置室溫 1~5min。

    4、 用濾紙小心吸去切片周圍的多余ye體,立即在切片上滴加 54μl TdT 酶反應ye,置濕盒

    中于 37C 反應 1hr(注意:陰性染色對照,加不含 TdT 酶的反應ye)。

    5、將切片置于染色缸中,加入已預熱到 37℃的洗滌與終止反應緩沖ye,于 37℃保溫 30min,

    每 10min 將載玻片輕輕提起和放下一次,使ye體輕微攪動。

    6、 組織切片用 PBS 洗 3 次,每次 5min 后,直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗

    地gao辛抗體,于濕盒中室溫反應 30min。

    7、用 PBS 洗 4 次,每次 5min。

    8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的 0.05%DAB 溶ye,室溫顯色 3~6min。

    9、用蒸餾水洗 4 次,前 3 次每次 1min,后 1 次 5min。10、 于室溫用甲基綠進行復染 10min。用蒸餾水洗 3 次,前兩次將載玻片提起放下 10 次,

    后 1 次靜置 30s。依同樣方法再用 100%正丁醇洗三次。

    11、 用二甲苯脫水 3 次,每次 2min,封片、干燥后,在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結

    果。

    (三)注意事項

    一定要設立陽性和陰性細胞對照。陽性對照的切片可使用 DNaseI 部分降解的標本,陽性細

    胞對照可使用地塞米松(1μM)處理 3-4hr 的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰

    性對照不加 TdT 酶,其余步驟與實驗組相同。

    一、吖啶橙(簡稱 AO)熒光染色法

    原理:吖啶橙(Acridine Orange)是吖啶的衍生物之一。它是一種熒光染料,激發峰 492nm,

    熒光發射峰 530nm(DNA),640nm(RNA),它與雙鏈 DNA 的結合方式是嵌入雙鏈之間,

    而與單鏈 DNA 和 RNA 則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍光(給 502nm)激發下,細胞

    核發亮綠色熒光(約 530nm),核仁和胞質 RNA 發桔紅色熒光(>580nm)。吖啶橙的陽離子

    也可以結合在蛋白質、多糖和膜上而發熒光,但細胞固定阻抑了這種結合,從而主要顯示

    DNA、RNA 兩種核酸。

    (1)試劑

    AO 貯備ye:

    AO 50mg(分析純)

    蒸餾水 50ml

    4℃冰箱保存 4 個月。

    Tris 緩沖ye:Tris 50mmol/L

    MgCl2 2.5mmol/L

    KCl 25mmol/L

    AO 工作ye:

    將 AO 貯備ye 10:1 用蒸餾水稀釋,再用 Tris 緩沖ye將 AO 稀釋到 8.5μg/ml 的終濃度。

    (2)操作步驟

    ①取乙醇固定的細胞懸ye,濃度為 107/ml,1500r/min,5 分鐘,棄乙醇。

    ②加入 2ml AO 工作ye,室溫染 10 分鐘。

    ③滴在載玻片上,加緩沖甘油封片。

    ④在熒光顯微鏡下用吸收波長 405nm,發射波長 530-640nm 觀察。

    結 果:活細胞核呈黃綠色熒光,胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜

    內側,可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

    二、Hoechst33258 染色

    Hoechst33258 為特異性 DNA 染料,,與 A-T 鍵結合,但在 pH2.0 環境下則優先與 RNA

    結合,染色 DNA 時應調整染ye的 pH 至 7.0,這種染料不溶于磷酸緩沖ye;所以配制時必

    須先以蒸餾水溶解配成儲存ye在 4℃中避光保存。

    本方法是用于培養細胞、細胞涂片或細胞甩片。

    試劑及配制

    (1)Hoechst33258 貯存ye:稱取 Hoechst33258 試劑 1mg,用 20ml 蒸餾水溶解后,濾過,

    4℃避光保存。用時蒸餾水 10 倍稀釋成染色ye。

    (2) 0.01molPBS,pH7.2。

    (3)封片ye(pH5.5):20mmol/L 檸檬酸,50mmol/L 磷酸氫二鈉,50%甘油。(4)細胞固定ye:甲醇/冰乙酸(3:1),現配。

    操作方法

    (1)原代細胞培養、細胞學涂片或細胞甩片機制制備的單細胞片。

    (2)細胞固定ye 4℃固定 5min。

    (3)蒸餾水稍洗后,點加 Hoechst33258 染色ye,10min。

    (4)蒸餾水洗片后,用濾紙沾去多余ye體。

    (5)封片劑封片后熒光顯微鏡觀察。

    結果:在熒光顯微鏡下,活細胞核呈彌散、均勻熒光,壞死細胞不被 Hoechst 染色。出現

    細胞凋亡時,細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀藍色熒光及明顯核形態變化,如果

    見到 3 個或 3 個以上的 DNA 熒光碎片被認為是凋亡細胞。

    三、甲基綠-派諾寧染色法

    (一)原理

    細胞凋亡和細胞壞死均可表現為細胞核固縮等細胞死亡形態,但兩者發生機制不同。細胞凋

    亡是一種細胞主動死亡過程,需要有細胞內蛋白酶的激活,細胞質內常有 mRNA 表達的增

    強。而細胞壞死是一種被動的細胞死亡過程,細胞質內常有 RNA 的損失。根據這一特點,

    可應用試劑甲基綠對 DNA 染色的特異性和派諾寧對 RNA 的親和性,使甲基綠對固縮細胞

    核內的脫氧核糖核酸著染,如果細胞質內核糖核酸呈派諾寧陽性染色者為凋亡細胞,呈陰性

    染色者為壞死細胞。

    (二)試劑及配制

    1. 組織固定ye

    無水乙醇 600ml

    氯fang 300ml冰醋酸 100ml

    2.甲基綠純化 新購買的甲基綠需用氯fang進行純化處理以去除甲基紫。方法是將 2%甲基綠

    水溶ye 20ml 傾入潔凈分ye漏斗,加入氯fang 20ml 充分,使其內的甲基溶于氯fang中而呈紫紅

    色。旋動分ye漏斗下部的砂塞,慢慢把下沉帶比紅色的氯fang移去,再加入新的氯fang 10ml,

    如此反復更換氯fang,直到無紫紅色為止。該ye作為貯存ye,4℃保存。

    3.染色ye

    甲基綠貯存ye 5ml

    5%派諾寧水溶ye 1ml

    蒸餾水 12ml

    0.2mol/L 乙酸鈉(pH4.8) 18ml

    臨用前配制,濾紙過濾。

    (三)操作方法

    1.新鮮取材組織置固定ye中 4℃固定 3-6h(或培養細胞、細胞學甩片固定 10min)。

    2.直接轉入 95%乙醇脫水和無水乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。

    3.切片經二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化至蒸餾水。(細胞學涂片不用梯度酒精)

    4.置染色ye中室溫下染色約 1h。

    5.取出切片,不經水洗,用濾紙吸干多余染ye。

    6.插入丙酮中迅速分化。

    7.轉入丙酮二甲苯(1:1)稍洗。

    8.二甲苯透明 2-3 次。

    9.中性樹膠封固。

    (四)結果光學顯微鏡下凋亡細胞固縮,細胞核呈綠色或綠藍色著染,胞質呈紅紫色著染,壞死細胞只

    有固縮細胞核呈綠色著染。觀察時可用凋亡指數進行計數,即隨機選擇約 10-20 個視野(每

    張切片約 1000-2500 個細胞),計數凋亡細胞百分率。

    四、TdT 介導的 dUTP 缺口末端標記技術(TUNEL)

    原理:在機體內部隨時都在發生著細胞的死亡。傳統上用顯微鏡來觀察細胞的死亡,其特征

    為核染色質的濃縮及碎片的形成。但是這種現象出現的很晚,時間也很短暫。凋亡的特征是

    內源性核酸內切酶被激活,細胞自身的染色質或 DNA 被切割,出現單鏈或雙鏈缺口,并產

    生與 DNA 斷點數目相同的 3?ˉ-OH 末端。

    末端脫氧核糖核酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT)可以將地gao辛標

    記的 dUTP(DIG-dUTP)標記至 3’-OH 末端,DIG-dUTP(核苷酸)結合在 DNA 斷點部位,

    可以通過生物標記的抗地gao辛抗體(Anti-DIG-Biotin)反應后,再結合鏈酶親和素-過氧化物

    酶(SABC),然后加入顯色底物 DAB 予以顯示。凋亡的細胞核呈棕黃色,從而可以在顯微鏡

    下觀察到著色的凋亡細胞。

    試劑

    1.標記緩沖ye(Labeling Buffer)

    5×濃度的 TdT 反應緩沖ye,含有以下成分:

    500mmol/L 二甲胂酸鉀。pH7.2

    10mmol/L CoCl2 (氯化鈷)

    1mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)

    2.末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT,×20)

    3.DIG-dUTP(×20) 4.封閉ye(Blocking Reagent)

    5.生物素化抗地gao辛抗體(×100)

    6.SABC(×100)

    7.ProteinaseK(×200)

    8.抗體稀釋ye

    9. 多聚賴氨酸或 APES。

    10. 0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 雙蒸餾水中加入 8.5 克氯化鈉,1.2 克 Tris 和 0.45-0.5ml

    純乙酸。)

    11. DAB 顯色試劑。

    操作步驟

    1.樣品處理

    (1)玻片預先用多聚賴氨酸或 APES 進行處理。

    (2)細胞涂片和冰凍切片:重要的是及時固定。用 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0-7.6)

    室溫下固定 30-60 分鐘。0.01M PBS 洗 2 分鐘×2 次。蒸餾水洗滌 2 分鐘×2 次。

    (3)組織:有條件時應及時固定。常規 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0-7.6)或 10%中性緩

    沖福爾馬林固定 4 小時以上,石蠟包埋。切片常規脫蠟入水(脫蠟務必干凈)。

    2.新鮮配制 3%H2O2,室溫處理 10 分鐘。蒸餾水洗滌 2 分鐘×3 次。

    3.標本片加 0.01M TBS1:200 新鮮稀釋 Proteinase K37℃消化 5-15 分鐘,0.01M TBS 洗

    2 分鐘×3 次。

    (細胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化 10-60 秒鐘。新鮮石蠟切片消化 5-10

    分鐘。陳舊石蠟切片消化 10-30 分鐘)。

    4.標本片加標記緩沖ye(Labeling Buffer)20μl/片,以保持切片濕潤。按每張切片取 TdT 和

    DIG-d-UTP 各 1μl,加入 18μl 標記緩沖ye中,混勻。甩去切片上多余ye體后加標記ye,20μl/片。置樣品于濕盒中,37℃標記 2 小時。

    5.0.01M TBS 洗 2 分鐘×3 次。

    6.加封閉ye 50μl/片,室溫 30 分鐘,甩掉封閉ye,不洗。

    7.用抗體稀釋ye 1:100 稀釋生物素化抗地gao辛抗體:(取 1ml 抗體稀釋ye加生物素化抗地高

    辛抗體 10μl),混勻后 50μl/片加至標本片上。置樣品于濕盒中,37℃反應 30 分鐘。0.01M

    TBS 洗 2 分鐘×3 次。

    8.用抗體稀釋ye 1:100 稀釋 SABC:取 1ml 抗體稀釋ye加 SABC10μl,混勻后 50μl/片加至

    切片。37℃反應 30 分鐘。0.01M TBS 洗 5 分鐘×4 次。

    9.DAB 顯色。

    10.蘇木素輕度復染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。

    結果判定細胞核固縮有的呈碎片狀,不規則,大小不一致,呈棕黃色顆粒者為陽性細胞。 即

    凋亡的細胞

    TUNEL 改良方法在細胞凋亡檢測中的應用

    材料和方法

    1.1 材料 取手術下新鮮組織,恒冷切片 5μm,4%多聚甲醛緩沖ye固定 4-8 小時,載玻片

    用 APES 處理,同時連續切片、1%火棉膠、0.01MPpH7.4PBS、3%H2O2、1.0M 枸櫞酸

    鹽緩沖ye、通透ye(0.1%Triton-100、0.1 枸櫞酸鈉)、標記緩沖ye(pH6.8):二甲胂酸鈉

    100mmol/L 標記、二巰基蘇糖醇 0.1mmol/L,氯化鈷(coci)。

    * TdT 反應ye;標記緩沖ye(pH6.8)中加 TdT 酶 100U/ml,biotin-dUTP;鏈霉菌素標記的

    辣根過氧化物酶,蛋白酶 K(20μg/ml)。

    * 顯色劑 氨乙基咔唑(amino ethyl carbazole,AEC)的 配制AEC 20mg

    二甲酰胺 DMF 2.5ml

    0.05M 醋酸緩沖ye(pH5.5) 50ml

    0.3%H2O2 0.5ml

    1.2 實驗步驟

    (1)切片用冷風吹干后為防止冰凍切片脫片用 1%火棉膠封片 1 分鐘,PBS 漂洗 3×5 分鐘;

    (2)3%H2O2 阻斷 10 分鐘后 PBS 洗 3×5 分鐘;

    (3)組織切片浸泡于盛有 1.0mol/L 枸櫞酸鹽緩沖ye的燒杯中,置于微波爐內,在 650W,

    輻射時間 15min 的條件下進行組織處理。冷卻至室溫。

    (4)放在通透ye(0.1%Triton -100 溶于 0.1%枸櫞酸鈉溶ye)中室溫 20 分鐘,PBS 漂洗

    3×5 分鐘;

    (5)滴加 50μl TdT 反應ye 37℃1h,PBS 漂洗 3×5 分鐘;(6)滴加 50μl biotin-dUTP,反

    應ye 37℃1h,PBS 漂洗 3×5 分鐘;(7)滴加 50μl 鏈霉菌標記辣根過氧化物酶ye 37℃孵育

    30 分鐘,(8)PBS 漂洗 3×5 分鐘, AEC-H2O2 顯色 10-15 分鐘,蘇木素復染(用 1%的酸

    性水分化),水洗、水溶性封片。陽性對照 dTd 反應前用 20μg/ml 蛋白酶 K 處理切片。陰

    性對照用 PBS 代替 dTd 反應ye。

    1.3 結果判斷及標準 改良的方法:凋亡細胞核呈紅色固縮,有白邊集或碎列,細胞膜皺褶,

    有的卷曲和出泡,在計數時避開壞死區域,以避免假陽性。計數 500 個細胞中的凋亡細胞

    數目,得出凋亡百分率。凋亡染色分度如下:每個高倍視野平均 1-3 個為Ⅰ級;3-6 個為Ⅱ

    級;6-10 個為Ⅲ級;>10 個者為 IV 級。陽性對照:經在 dTd 反應認前用 20μg/ml 蛋白酶,

    處理切片 30 分鐘的切片同改良方法基本相同,但紅色較淺。陰性對照:切片無棕色反應。

    評價正常的或正在增殖的細胞沒有 DNA 的斷裂,沒有 3’-OH 末端被標記,因此鏡下無顯色的

    物質。這種分子生物學與形態學相結合的方法,可以對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進

    行標記,準確反應細胞凋亡典型的生物化學與形態學特征,靈敏度遠遠高于一般的組織化

    學和生物化學方法。在檢測過程中,可設陰性對照(不加 TdT)陽性對照(已知的陽性標本)。

    注意:AEC 孵育切片,反應產物為紅色??捎锰K木精對襯染色,反應產物是純酒精溶性的,

    因此??捎盟嵝运躽e分化,然后用水溶性封固劑封片。

    五、凋亡細胞:凝膠電泳檢測

    前已提及凋亡細胞的突出特征是由于內源性核酸內切酶的激活而導致細胞核 DNA 的斷裂。

    典型的細胞凋亡,在核內形成大量 200bp 大小及其倍體的核苷酸片段,而非典型的凋亡細

    胞,由于核內的 DNA 降解不完全,僅形成 300~50kb 的 DNA 大片。利用這一特性,可通

    過 DNA 凝膠電泳來判定凋亡的發生和發展情況。

    試劑

    1. PBS 緩沖ye

    2. 消化ye的配制:

    100mmol/L NaCl

    10mmol/L Tris-HCL(pH8.0)

    25mmol/L EDTA(pH8.0)

    0.5%SDS

    0.2mg/ml 蛋白酶 K

    3. 酚:氯fang:異戊醇混合ye按 25:24:1 比例配制。

    4. 氯fang:異戊醇混合ye按 24:1 比例配制。

    5. 醋酸銨,7.5mol/L。6. 100%和 70%的乙醇。

    7. TE 緩沖ye(pH8.0):100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA。

    8. TBE 緩沖ye。

    9. 電泳儀。

    10. UV 透射儀。

    11. 照相設備。

    12. 不含 DNA 酶的 RNA 酶。

    13. 2%凝膠的配制:取凝膠粉 2g,溶于 100ml 0.5 倍的 TBE 緩沖ye中,加熱至沸騰,攪

    拌使其均勻。待凝膠溫度降至 50℃時,倒入模板待其凝固。

    14.溴化乙啶(EB):10mg/ml 水溶ye。

    15.DNA 分子量標準物(Bio-Rad Lab,hercules,CA,USA)。

    操作步驟

    1.培養的懸浮細胞經離心(300g,5min)去上清ye后,用冷(4℃)PBS 緩沖ye洗滌二次;培養

    的貼壁細胞經用胰蛋白酶消化后收集,同樣方法洗滌二次,離心并去掉上清,僅留細胞沉積

    物。

    2.向細胞沉積物中加入消化ye,混勻后,于 50℃孵育 12-16h。

    3.用酚:氯fang:異戊醇混合ye抽提一次,再用氯fang:異戊醇混合ye抽提二次。其中每次加入

    抽提ye后混勻 5min,然后以 3600g 離心 5min,吸取抽提物。

    4.向抽提物中加入 醋酸銨,至終濃度為 2.5mol/L,混勻后,加入二倍體積的 100%乙醇,

    4℃下靜置 2h。

    5.將抽提物以 12000g 在室溫下離心 30min,棄去上清。

    6.用 70%乙醇重復上述步驟,洗滌一次,棄去上清。7.真空抽干或空氣干燥 DNA 抽提物。

    8.將提取的 DNA 用 TE 緩沖ye溶解。

    9.取 10μl 溶于 TB ye的 DNA 抽提物,加入 0.1U 的無 DNA 酶的 RNA 酶,于 37℃孵育 1h。

    10.吸取樣品,在 2%的凝膠孔內加樣;并在第1孔內加入分子量標記物。

    11.將凝膠置于 0.5 倍 TBE 緩沖ye的電泳槽內,按 4V/cm 電壓電泳 7h。

    12.將電泳后的凝膠置于 0.5μg/ml 的 EB 水溶ye中染色 30min。

    13.用雙蒸水洗滌凝膠 1~2h,其間換水數次。

    結果觀察

    將凝膠置 UV 透射儀上觀察:典型的凋亡能看到 200bp 及其倍體的 DNA 梯帶。

    1 陰性對照

    2 細胞色素誘導 16 小時

    3 細胞色素誘導 36 小時(凋亡)

    4 細胞色素誘導 72 小時(凋亡)

    凝膠電泳特點

    (1) 本方法不能檢測單個細胞水平的凋亡。

    (2) 不能提供細胞發生凋亡所處的組織位置和細胞分化狀態。

    六、熒光染料染色-流式細胞測定凋亡細胞

    * 細胞凋亡在細胞學上發生一系列特征性變化,如細胞周期停滯、細胞膜表面蛋白質分子表

    達的水平及類型發生改變、細胞膜皺縮引起光散射性質發生相應的變化等。在細胞凋亡的早

    期,細胞對前向角光散射的能力顯著下降,但是對 90°角光散射的能力增加或沒有變化。前

    向角散射的上升或下降與細胞的大小有關,90 °角散射的改變與細胞內結構,特別是染色質的濃縮有關。

    * 在細胞凋亡晚期,前向角和右向角光散射的能力均降低。因此,通過流式細胞儀檢測細胞

    光散射的改變可以獲得凋亡細胞的一些信息。但是,細胞的機械損傷、分離獲得的細胞核、

    以及壞死細胞的前向角光散射能力也均表現下降。另外,晚期凋亡細胞,細胞膜表面蛋白可

    能丟失,凋亡細胞表型復雜化也使光散射能力的分析出現復雜的結果,因此單純前向角光散

    射降低不是凋亡細胞特有的標志。

    * 根據碘化丙啶(PI)只能使壞死細胞著色,而雙苯并咪唑(Ho)卻可穿越細胞膜對活細胞和凋

    亡細胞的 DNA 進行染色,在紫外光激發下產生不同顏色熒光的特點,因此采用單一 PI 或

    者 Ho 染色法,或者應用兩種染料通過復染并結合流式細胞儀的精確分析,可達到對凋亡細

    胞、壞死細胞和活細胞進行鑒別與定量的目的。

    七、電子顯微鏡觀察法

    透射電子顯微鏡已經用于凋亡細胞的檢測。鏡下可見凋亡細胞體積變小、細胞質濃縮、細胞

    核變小、染色質濃縮并凝結成塊,出現染色質沿核膜內側排列的核邊集現象。晚期的凋亡細

    胞,清晰可見細胞核裂解產生的凋亡小體。

    八、PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測:

    原理

    凋亡早期,細胞內膜的磷脂酰絲氨酸(PS)移位到細胞外膜,而熒光標記或生物素偶聯的

    annexin V(磷脂結合蛋白)極易檢測處于外膜的 PS,由于 PS 外膜化比凋亡引起的核酸變化

    更早,所以該試劑盒比 DNA 檢測法能更早期檢測細胞凋亡。九、mRNA 水平的檢測

    一些基因在細胞凋亡時表達異常,檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種

    常用方法。 作為凋亡前期( Bax )或抗凋亡( Bcl-2 和 bcl-X )的調節物,它們的表達

    水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。因此,通過定量 PCR(Quantative PCR)檢測這些

    凋亡相關基因 RNA 水平的表達,也可以對凋亡進行評價

    十、凋亡相關蛋白 TFAR19 蛋白的表達和細胞定位分析

    該分子表達廣泛,在原核和真核生物不同種屬間具有很高的同源性。該分子具有促進某些腫

    瘤細胞(HL60、MGC-803、MCF-7 等)凋亡的效應,可作為早期凋亡的信號評價指標。

    十一、活細胞 Bid(蛋白)轉位檢測

    Bcl2 家族蛋白 Bid 通常情況下位于細胞漿內,但在凋亡發生時,Bid 迅速轉入線粒體內,并

    引發了細胞色素 C 的釋放,因此,通過 Bid 蛋白的檢測可以監視凋亡前期的生化反應。

    細胞凋亡相關抗體

    * Fas(CD95)Monoclonal Antibody

    * Granzyme B Monoclonal Antibody

    * Fas Monoclonal Antibody

    * Apoptosis Sample

    * Bak Antibody

    * Bcl-xL Antibody

    * Caspase-10 Antibody

    * Cleaved Caspase-3* Cleaved DFF45(D224)Antibody

    * Cleaved PARP(D214)Antibody

    * DFF45/DFF35 Antibody

    * Phospho-Bcl-2(Ser70)Antibody

    細胞凋亡的醫學意義

    1. 凋亡在發生學中的作用

    ①在胚胎發育、器官形成過程中,必然伴隨著某些特定細胞群的凋亡,這些細胞群的凋亡是

    受基因控制的,可準時發生,呈現生理性細胞死亡或進行性細胞凋亡。

    ②淋巴系統的陰性選擇(negative selection),指在 T 淋巴細胞、B 淋巴細胞分化成熟時,

    機體經過嚴格的選擇機制,使那些編排細胞表面受體基因發生錯誤的細胞,以及有可能導致

    自身免疫性疾病的細胞(具有自身抗原的細胞)發生凋亡,使得淋巴細胞在成熟過程中,有

    95%的細胞以凋亡的方式被清除,僅有 5%左右的淋巴細胞從中樞免疫器官中被分化成熟。

    ③神經元發育過程中也存在陰性選擇機制,以清除那些有害的(即發生錯誤連接的)或無用的

    神經元,因此,有 50%的神經元細胞在發育成熟前以凋亡的方式被清除。

    2.凋亡與疾病

    現已發現凋亡機制的異常,即凋亡的增加或被抑制與一系列疾病的發生有關。

    (1)凋亡減少(抑制)所引起的疾病

    ①惡性腫瘤:有濾泡性淋巴瘤、P53 突變性腫瘤、激素依賴性腫瘤(乳腺癌、前列腺癌、卵

    巢癌)。

    ②自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡、自身免疫性腎小球腎炎。

    ③病毒感染性疾病如對皰疹病毒、麻疹病毒、腺病毒易感性引起的疾病。

    (2)凋亡增多引起的疾?、偕窠浽冃?,如帕金森病、側索硬化、色素性視網膜炎、小腦變性。

    ② 骨髓發育不良綜合征,如再生性障礙性貧血。

    ③ 缺血性損傷,如心肌梗死、卒中、再灌注性損傷。

    ④ 中毒性肝炎,如酒精性肝病。

    凋亡除與某些疾病發生有關,而且對許多疾病的治療有著極大的現實意義。腫瘤患者可通過

    基因治療啟動細胞凋亡機制,也可通過藥物(化療)來誘導和加速腫瘤細胞凋亡,以控制腫瘤

    的發展,并使其緩解。如在外科手術及器guang移zhi中的再灌注性損傷,可采取啟動抗凋亡基因

    或應用抗凋亡藥物,來促進愈合和恢復功能。

    細胞凋亡檢測,細胞凋亡實驗步驟,檢測方法

    一、 定性和定量研究

    只定性的研究方法:常規瓊脂糖凝膠電泳、脈沖場倒轉瓊脂糖凝膠電泳、形態學觀察(普通

    光學顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡)

    進行定量或半定量的研究方法:各種流式細胞儀方法、原位末端標記法、ELISA 定量瓊脂糖

    凝膠電泳。

    二、區分凋亡和壞死

    可將二者區分開的方法:瓊脂糖凝膠電泳,形態學觀察(透射電鏡是是區分凋亡和壞死可

    靠的方法),Hoechst33342/PI 雙染色法流式細胞儀檢測,AnnexinV/PI 雙染色法流式細

    胞儀檢測等。

    不能將二者區分開的方法:原位末端標記法、PI 單染色法流式細胞儀檢測等。

    三、樣品來源不同選擇

    組織:主要用形態學方法(HE 染色,透射電鏡、石蠟包埋組織切片進行原位末端標記,ELISA

    或將組織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電泳)。

    四、細胞凋亡檢測

    1、 早期檢測:

    1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測

    2)細胞內氧化還原狀態改變的檢測3)細胞色素 C 的定位檢測

    4) 線粒體膜電位變化的檢測

    2、 晚期檢測:

    細胞凋亡晚期中,核酸內切酶在核小體之間剪切核 DNA,產生大量長度在 180-200 bp 的

    DNA 的片段。

    對于晚期檢測通常有以下方法:

    1) TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的 dUTP 缺口末端標記)

    2) LM-PCR Ladder (連接介導的 PCR 檢測)

    3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)

    3、生化檢測:

    1)典型的生化特征:DNA 的片段化

    2)檢測方法主要有:瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標記(TUNEL)等

    3)TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的 dUTP 缺口末端標記)

    4)通過 DNA 末端轉移酶將帶標記的 dNTP (多為 dUTP)間接或直接接到 DNA 的片段的

    3’-OH 端,再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果??勺黾毎麘襶e、福爾馬林固定或石

    蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。

    4、LM-PCR Ladder (連接介導的 PCR 檢測)

    當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少(如活體組織切片)時,直接瓊脂糖電泳可能觀察

    不到核 DNA 的變化。通過 LM-PCR,連上特異性接頭,專一性地擴增梯度片段,從而靈敏

    地檢測凋亡時產生梯度片段。此外,LM-PCR 檢測是半定量的,因此相同凋亡程度的不同

    樣品可進行比較。如果細胞量很少,還可在分離提純 DNA 后,用 32P-ATP 和脫氧核糖核

    苷酸末端轉移酶(TdT)使 DNA 標記,然后進行電泳和放射自顯影,觀察凋亡細胞中 DNA ladder 的形成。

    上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核 DNA 斷裂這一特征,但細胞受到其它損傷(如機械損

    傷,紫外線等)也會產生這一現象,因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。需結

    合其它的方法來檢測細胞凋亡。

    其它方法:

    1)Telemerase Detection (端粒酶檢測)

    端粒酶是由 RNA 和蛋白組成,它可以自身 RNA 為模板逆轉錄合成端粒區重復序列,使細

    胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的,每分裂一次,染色體的端粒會縮短,

    這可能作為有絲分裂的一種時鐘,表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發現,

    90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。

    2)mRNA 水平的檢測

    研究者們發現了很多在細胞凋亡時表達異常的基因,檢測這些特異基因的表達水平也成為檢

    測細胞凋亡的一種常用方法。據報道,Fas 蛋白結合受體后能誘導癌細胞中的細胞毒性 T

    細胞(cytotoxic T cells)等靶細胞。Bcl-2 和 bcl-X (長的) 作為抗凋亡(bcl-2 和 bcl-X)

    的調節物,它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。用熒光定量 PCR 技術來檢測

    基因表達水平無疑比之前者更快更準確。通過檢測 fas, bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的

    mRNA 表達水平來進行細胞凋亡的檢測。

    5、細胞內氧化還原狀態改變的檢測:

    正常狀態下,谷光苷肽(GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通

    過被 GSH 還原而定期去除,氧化型的 GSH 又可被 GSH 還原酶迅速還原。這一反應在線粒

    體中尤為重要,許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。當細胞內 GSH 的排除非

    ?;钴S時,細胞ye就由還原環境轉為氧化環境,這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低,從而使細胞色素 C(三羧酸循環中的重要組分)從線粒體內轉移到細胞ye中,啟動凋

    亡效應器 caspase 的級聯反應。

    6、細胞色素 C 的定位檢測

    細胞色素 C 作為一種信號物質,在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下,它存在于

    線粒體內膜和外膜之間的腔中,凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞漿,結合 Apaf-1

    (apoptotic protease activating factor-1)后啟動 caspase 級聯反應:細胞色素 C/Apaf-1

    復合物激活 caspase-9,后者再激活 caspase-3 和其它下游 caspase。

    7、線粒體膜電位變化的檢測:

    1)線粒體跨膜電位的耗散與細胞凋亡有密切關系

    2)近年來陸續有報道說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活,也早于磷酯酰絲氨酸

    暴露于細胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散,細胞就會進入不可逆的凋亡過程。

    3)在細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內膜的通透性轉變,這是由

    于生成了動態的由多個蛋白質組成的位于線粒體內膜與外膜接觸位點的通透性轉變孔道(PT

    孔道)能穩定線粒體跨膜電位就能防止細胞凋亡。

    線粒體在細胞凋亡作用中的進一步證據:

    1)若將純化的正常的線粒體與純化的細胞核在一起保溫,并不導致細胞核的變化。但若將

    誘導生成 PT 孔道的線粒體與純化的細胞核一同保溫,細胞核即開始凋亡變化。

    2)形態學觀察,看到細胞數目有限,統計學上的準確性受影響;

    3)凝膠電泳檢測 DNA 破壞了細胞的完整性也不能測出凋亡細胞占總細胞的比例;

    4)流式細胞術可檢測細胞、亞細胞及分子水平的特征性變化。

    用于流式細胞儀檢測的染料:

    PI、Hoechst、 EB、 DAPI、丫啶橙等,其中 PI、Hoechst zui常用。PI 和 Hoechst33342 雙標:

    PI、Hoechst33342 均可與細胞核 DNA(或 RNA)結合。但是 PI 不能通過正常的細胞膜,

    Hoechst 則為膜通透性的熒光染料,故細胞在處于壞死或晚期調亡時細胞膜被破壞,這時

    可為 PI 著紅色。正常細胞和中早期調亡細胞均可被 Hoechst 著色,但是正常細胞核的

    Hoechst 著色的形態呈圓形,淡蘭色,內有較深的蘭色顆粒;而調亡細胞的核由于濃集而

    呈亮蘭色,或核呈分葉,碎片狀,邊集。

    故 PI 著色為壞死細胞;亮蘭色,或核呈分葉狀,邊集的 Hoechst 著色的為調亡細胞。

    PI 和 Annexin-V 雙標:

    磷脂酰絲氨酸(PS)正常位于細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期(或細胞損傷時)PS 可

    從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面,暴露在細胞外環境中。

    Annexin-V(green)可以和磷脂酰絲氨酸(PS)特異性結合。因此細胞處于調亡或壞死時,

    Annexin-V 可為陽性(早期的壞死細胞可能為陰性)。但是只有壞死的細胞 PI 是陽性

    五、形態學觀察

    1、普通光學顯微鏡觀察

    2、透射電子顯微鏡觀察

    3、熒光顯微鏡觀察

    1、普通光鏡下觀察:

    1)用蘇木素-伊紅(HE)染色:細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色(凋亡細胞),

    正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色,壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失

    2)Giemsa 染色法、瑞氏染色法等,正常細胞核的色澤均一,凋亡細胞染色變深,壞死細胞

    染色淺或沒染上顏色直接用倒置顯微鏡觀察:

    1)細胞體積變小,全面皺縮;

    2)凋亡小體為數個圓形小體圍繞在細胞周圍。

    2、透射電子顯微鏡觀察

    凋亡細胞體積變小,細胞質濃縮。

    細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期:Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣,

    部分染色質出現濃縮狀態;Ⅱa 期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;Ⅱb 期的細胞核裂解

    為碎塊,產生凋亡小體。

    3、熒光顯微鏡

    常用的熒光染料:丫啶橙、 PI 、DAPI、Hoechst33258 和 Hoechst33342、EB 等

    Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI 三種染料與 DNA 的結合是非嵌入式的,主要

    結合在 DNA 的 A-T 堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。

    1)PI 雙染色法基本原理

    Hoechst 是與 DNA 特異結合的活性染料,能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作

    用。Hoechst 33342 在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。

    DAPI 為半通透性,用于常規固定細胞的染色。

    碘化丙啶(PI)是一種核酸染料,它不能透過完整的細胞膜,但在凋亡中晚期的細胞和死細胞,

    PI 能夠透過細胞膜而將細胞核染紅。因此將 Annexin-V 與 PI 匹配使用,就可以將凋亡早

    晚期的細胞以及死細胞區分開來。

    注意事項:細胞凋亡時,其 DNA 可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一,但這種 DNA

    可染性降低也可能是因為 DNA 含量的降低,或者是因為 DNA 結構的改變使其與染料結合

    的能力發生改變所致。在分析結果時應該注意。六、細胞凋亡的分子生物學檢測方法:

    細胞凋亡中染色體 DNA 的斷裂是個漸進的分階段的過程,染色體 DNA 首先在內源性的核

    酸水解酶的作用下降解為 50-300kb 的大片段。然后大約 30 ﹪的染色體 DNA 在 Ca ²+和

    Mg²+依賴的核酸內切酶作用下,在核小體單位之間被隨機切斷,形成 180~200bp 核小

    體 DNA 多聚體。DNA 雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列 DNA 的 3’-OH

    末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下,將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧

    化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到 DNA 的 3’-末端,從而可進行凋亡細

    胞的檢測,這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)。

    由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA 的斷裂,因而沒有 3’-OH 形成,很少能夠被

    染色。低分子量的 DNA 分離后,也可使用 DNA 聚合酶進行缺口翻譯(nick translation),

    使低分子量的 DNA 標記或染色,然后分析凋亡細胞。TUNEL 或缺口翻譯法實際上是分子

    生物學與形態學相結合的研究方法,對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色,能

    準確的反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征,可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切

    片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定,并可檢測出極少量的凋亡細胞,靈

    敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高,因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。

    過氧化物酶標記測定法

    原理:脫氧核糖核苷酸衍生物地gao辛[(digoxigenin)-11-dUTP]在 TdT 酶的作用下,可

    以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈 DNA 的 3-OH 末端,與 dATP 形成異多聚體,并可與連接了

    報告酶(過氧化物酶或堿性磷酸酶)的抗地gao辛抗體結合。在適合底物存在下,過氧化物酶

    可產生很強的顏色反應,特異準確的定位出正在凋亡的細胞,因而可在普通光學顯微鏡下進

    行觀察。毛地黃植物是地gao辛的唯1來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地gao辛杭體結合的配

    體,因而非特異性反應很低??沟豨ao辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到

    1%,若此抗體的 Fc 部分通過蛋白酶水解的方法除去后,則可完全排除細胞 Fc 受體非特異

    性的吸附作用。

    本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養的或從組織中分離的

    細胞凋亡測定。

    (一)試劑配制

    1、磷酸緩沖ye PBS(pH7.4):磷酸鈉鹽 50mM,NaCl 200mM。

    2、蛋白酶 K(200μg/ml,pH7.4):蛋白酶 K 0.02g;PBS 100ml。

    3、含 2%H2O2 的 PBS 緩沖ye(pH7.4):H2O2 2.0ml;PBS 緩沖ye 98.0ml。

    4、TdT 酶緩沖ye(新鮮配):Trlzma 堿 3.63g 用 0.1N HCl 調節 pH 至 7.2,加 ddH2O

    定容到 1000ml;再加入二甲砷suan鈉 29.96g 和氯化鈷 0.238g。

    5、TdT 酶反應ye:TdT 酶 32μl;TdT 酶緩沖ye 76μl,混勻,置于冰上備用。

    6、洗滌與終止反應緩沖ye:氯化鈉 17. 4g;檸檬酸鈉 8.82g;ddH2O 1000ml

    7、0.05%二氨基聯苯(DAB)溶ye:DAB 5mg;PBS 10ml,pH7.4, 臨用前過濾后,加

    過氧化氫至 0.02%。

    8、0.5%甲基綠(pH4.0):甲基綠 0.5g;0.1M 乙酸鈉 100ml。

    9、100%丁醇,100%、95%、90%、80%和 70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶ye,

    乙酸,松香水等。

    10、 過氧化物酶標記的抗地gao辛抗體(ONCOR)

    (二)實驗步驟

    1、標本預處理:(1)石蠟包埋的組織切片預處理:將組織切片置于染色缸中,用二甲苯洗兩次,每次 5min。

    用無水乙醇洗兩次,每次 3min。用 95%和 75%乙醇各洗一次,每次 3min。用 PBS 洗 5min

    加入蛋白酶 K 溶ye(20ug/ml),于室溫水解 15min,去除組織蛋白。用蒸餾水洗 4 次,

    每次 2min,然后按下述步驟 2 進行操作。

    (2)冰凍組織切片預處理:將冰凍組織切片置 10%中性甲醛中,于室溫固定 10min 后,

    去除多余ye體。用 PBS 洗兩次,每次 5min。置乙醇:乙酸(2:1)的溶ye中,于-20℃處

    理 5min,去除多余ye體。用 PBS 洗兩次,每次 5min,然后按下述步驟 2 進行操作。

    (3)培養的或從組織分離的細胞的預處理:將約 5 × 107 個/ml 細胞于 4%中性甲醛室溫

    中固定 10min。在載玻片上滴加 50~100μl 細胞懸ye并使之干燥。用 PBS 洗兩次,每次

    5min,然后按下述步驟 2 進行操作。

    2、色缸中加入含 2%過氧化氫的 PBS,于室溫反應 5min。用 PBS 洗兩次,每次 5min。

    3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余ye體,立即在切片上加 2 滴 TdT 酶緩沖ye,

    置室溫 1~5min。

    4、 用濾紙小心吸去切片周圍的多余ye體,立即在切片上滴加 54μl TdT 酶反應ye,置濕盒

    中于 37C 反應 1hr(注意:陰性染色對照,加不含 TdT 酶的反應ye)。

    5、將切片置于染色缸中,加入已預熱到 37℃的洗滌與終止反應緩沖ye,于 37℃保溫 30min,

    每 10min 將載玻片輕輕提起和放下一次,使ye體輕微攪動。

    6、 組織切片用 PBS 洗 3 次,每次 5min 后,直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗

    地gao辛抗體,于濕盒中室溫反應 30min。

    7、用 PBS 洗 4 次,每次 5min。

    8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的 0.05%DAB 溶ye,室溫顯色 3~6min。

    9、用蒸餾水洗 4 次,前 3 次每次 1min,后 1 次 5min。10、 于室溫用甲基綠進行復染 10min。用蒸餾水洗 3 次,前兩次將載玻片提起放下 10 次,

    后 1 次靜置 30s。依同樣方法再用 100%正丁醇洗三次。

    11、 用二甲苯脫水 3 次,每次 2min,封片、干燥后,在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結

    果。

    (三)注意事項

    一定要設立陽性和陰性細胞對照。陽性對照的切片可使用 DNaseI 部分降解的標本,陽性細

    胞對照可使用地塞米松(1μM)處理 3-4hr 的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰

    性對照不加 TdT 酶,其余步驟與實驗組相同。

    一、吖啶橙(簡稱 AO)熒光染色法

    原理:吖啶橙(Acridine Orange)是吖啶的衍生物之一。它是一種熒光染料,激發峰 492nm,

    熒光發射峰 530nm(DNA),640nm(RNA),它與雙鏈 DNA 的結合方式是嵌入雙鏈之間,

    而與單鏈 DNA 和 RNA 則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍光(給 502nm)激發下,細胞

    核發亮綠色熒光(約 530nm),核仁和胞質 RNA 發桔紅色熒光(>580nm)。吖啶橙的陽離子

    也可以結合在蛋白質、多糖和膜上而發熒光,但細胞固定阻抑了這種結合,從而主要顯示

    DNA、RNA 兩種核酸。

    (1)試劑

    AO 貯備ye:

    AO 50mg(分析純)

    蒸餾水 50ml

    4℃冰箱保存 4 個月。

    Tris 緩沖ye:Tris 50mmol/L

    MgCl2 2.5mmol/L

    KCl 25mmol/L

    AO 工作ye:

    將 AO 貯備ye 10:1 用蒸餾水稀釋,再用 Tris 緩沖ye將 AO 稀釋到 8.5μg/ml 的終濃度。

    (2)操作步驟

    ①取乙醇固定的細胞懸ye,濃度為 107/ml,1500r/min,5 分鐘,棄乙醇。

    ②加入 2ml AO 工作ye,室溫染 10 分鐘。

    ③滴在載玻片上,加緩沖甘油封片。

    ④在熒光顯微鏡下用吸收波長 405nm,發射波長 530-640nm 觀察。

    結 果:活細胞核呈黃綠色熒光,胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜

    內側,可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

    二、Hoechst33258 染色

    Hoechst33258 為特異性 DNA 染料,,與 A-T 鍵結合,但在 pH2.0 環境下則優先與 RNA

    結合,染色 DNA 時應調整染ye的 pH 至 7.0,這種染料不溶于磷酸緩沖ye;所以配制時必

    須先以蒸餾水溶解配成儲存ye在 4℃中避光保存。

    本方法是用于培養細胞、細胞涂片或細胞甩片。

    試劑及配制

    (1)Hoechst33258 貯存ye:稱取 Hoechst33258 試劑 1mg,用 20ml 蒸餾水溶解后,濾過,

    4℃避光保存。用時蒸餾水 10 倍稀釋成染色ye。

    (2) 0.01molPBS,pH7.2。

    (3)封片ye(pH5.5):20mmol/L 檸檬酸,50mmol/L 磷酸氫二鈉,50%甘油。(4)細胞固定ye:甲醇/冰乙酸(3:1),現配。

    操作方法

    (1)原代細胞培養、細胞學涂片或細胞甩片機制制備的單細胞片。

    (2)細胞固定ye 4℃固定 5min。

    (3)蒸餾水稍洗后,點加 Hoechst33258 染色ye,10min。

    (4)蒸餾水洗片后,用濾紙沾去多余ye體。

    (5)封片劑封片后熒光顯微鏡觀察。

    結果:在熒光顯微鏡下,活細胞核呈彌散、均勻熒光,壞死細胞不被 Hoechst 染色。出現

    細胞凋亡時,細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀藍色熒光及明顯核形態變化,如果

    見到 3 個或 3 個以上的 DNA 熒光碎片被認為是凋亡細胞。

    三、甲基綠-派諾寧染色法

    (一)原理

    細胞凋亡和細胞壞死均可表現為細胞核固縮等細胞死亡形態,但兩者發生機制不同。細胞凋

    亡是一種細胞主動死亡過程,需要有細胞內蛋白酶的激活,細胞質內常有 mRNA 表達的增

    強。而細胞壞死是一種被動的細胞死亡過程,細胞質內常有 RNA 的損失。根據這一特點,

    可應用試劑甲基綠對 DNA 染色的特異性和派諾寧對 RNA 的親和性,使甲基綠對固縮細胞

    核內的脫氧核糖核酸著染,如果細胞質內核糖核酸呈派諾寧陽性染色者為凋亡細胞,呈陰性

    染色者為壞死細胞。

    (二)試劑及配制

    1. 組織固定ye

    無水乙醇 600ml

    氯fang 300ml冰醋酸 100ml

    2.甲基綠純化 新購買的甲基綠需用氯fang進行純化處理以去除甲基紫。方法是將 2%甲基綠

    水溶ye 20ml 傾入潔凈分ye漏斗,加入氯fang 20ml 充分,使其內的甲基溶于氯fang中而呈紫紅

    色。旋動分ye漏斗下部的砂塞,慢慢把下沉帶比紅色的氯fang移去,再加入新的氯fang 10ml,

    如此反復更換氯fang,直到無紫紅色為止。該ye作為貯存ye,4℃保存。

    3.染色ye

    甲基綠貯存ye 5ml

    5%派諾寧水溶ye 1ml

    蒸餾水 12ml

    0.2mol/L 乙酸鈉(pH4.8) 18ml

    臨用前配制,濾紙過濾。

    (三)操作方法

    1.新鮮取材組織置固定ye中 4℃固定 3-6h(或培養細胞、細胞學甩片固定 10min)。

    2.直接轉入 95%乙醇脫水和無水乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。

    3.切片經二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化至蒸餾水。(細胞學涂片不用梯度酒精)

    4.置染色ye中室溫下染色約 1h。

    5.取出切片,不經水洗,用濾紙吸干多余染ye。

    6.插入丙酮中迅速分化。

    7.轉入丙酮二甲苯(1:1)稍洗。

    8.二甲苯透明 2-3 次。

    9.中性樹膠封固。

    (四)結果光學顯微鏡下凋亡細胞固縮,細胞核呈綠色或綠藍色著染,胞質呈紅紫色著染,壞死細胞只

    有固縮細胞核呈綠色著染。觀察時可用凋亡指數進行計數,即隨機選擇約 10-20 個視野(每

    張切片約 1000-2500 個細胞),計數凋亡細胞百分率。

    四、TdT 介導的 dUTP 缺口末端標記技術(TUNEL)

    原理:在機體內部隨時都在發生著細胞的死亡。傳統上用顯微鏡來觀察細胞的死亡,其特征

    為核染色質的濃縮及碎片的形成。但是這種現象出現的很晚,時間也很短暫。凋亡的特征是

    內源性核酸內切酶被激活,細胞自身的染色質或 DNA 被切割,出現單鏈或雙鏈缺口,并產

    生與 DNA 斷點數目相同的 3?ˉ-OH 末端。

    末端脫氧核糖核酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT)可以將地gao辛標

    記的 dUTP(DIG-dUTP)標記至 3’-OH 末端,DIG-dUTP(核苷酸)結合在 DNA 斷點部位,

    可以通過生物標記的抗地gao辛抗體(Anti-DIG-Biotin)反應后,再結合鏈酶親和素-過氧化物

    酶(SABC),然后加入顯色底物 DAB 予以顯示。凋亡的細胞核呈棕黃色,從而可以在顯微鏡

    下觀察到著色的凋亡細胞。

    試劑

    1.標記緩沖ye(Labeling Buffer)

    5×濃度的 TdT 反應緩沖ye,含有以下成分:

    500mmol/L 二甲胂酸鉀。pH7.2

    10mmol/L CoCl2 (氯化鈷)

    1mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)

    2.末端脫氧核糖核酸轉移酶(TdT,×20)

    3.DIG-dUTP(×20) 4.封閉ye(Blocking Reagent)

    5.生物素化抗地gao辛抗體(×100)

    6.SABC(×100)

    7.ProteinaseK(×200)

    8.抗體稀釋ye

    9. 多聚賴氨酸或 APES。

    10. 0.01M TBS,PH7.5(配法:1L 雙蒸餾水中加入 8.5 克氯化鈉,1.2 克 Tris 和 0.45-0.5ml

    純乙酸。)

    11. DAB 顯色試劑。

    操作步驟

    1.樣品處理

    (1)玻片預先用多聚賴氨酸或 APES 進行處理。

    (2)細胞涂片和冰凍切片:重要的是及時固定。用 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0-7.6)

    室溫下固定 30-60 分鐘。0.01M PBS 洗 2 分鐘×2 次。蒸餾水洗滌 2 分鐘×2 次。

    (3)組織:有條件時應及時固定。常規 4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0-7.6)或 10%中性緩

    沖福爾馬林固定 4 小時以上,石蠟包埋。切片常規脫蠟入水(脫蠟務必干凈)。

    2.新鮮配制 3%H2O2,室溫處理 10 分鐘。蒸餾水洗滌 2 分鐘×3 次。

    3.標本片加 0.01M TBS1:200 新鮮稀釋 Proteinase K37℃消化 5-15 分鐘,0.01M TBS 洗

    2 分鐘×3 次。

    (細胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化 10-60 秒鐘。新鮮石蠟切片消化 5-10

    分鐘。陳舊石蠟切片消化 10-30 分鐘)。

    4.標本片加標記緩沖ye(Labeling Buffer)20μl/片,以保持切片濕潤。按每張切片取 TdT 和

    DIG-d-UTP 各 1μl,加入 18μl 標記緩沖ye中,混勻。甩去切片上多余ye體后加標記ye,20μl/片。置樣品于濕盒中,37℃標記 2 小時。

    5.0.01M TBS 洗 2 分鐘×3 次。

    6.加封閉ye 50μl/片,室溫 30 分鐘,甩掉封閉ye,不洗。

    7.用抗體稀釋ye 1:100 稀釋生物素化抗地gao辛抗體:(取 1ml 抗體稀釋ye加生物素化抗地高

    辛抗體 10μl),混勻后 50μl/片加至標本片上。置樣品于濕盒中,37℃反應 30 分鐘。0.01M

    TBS 洗 2 分鐘×3 次。

    8.用抗體稀釋ye 1:100 稀釋 SABC:取 1ml 抗體稀釋ye加 SABC10μl,混勻后 50μl/片加至

    切片。37℃反應 30 分鐘。0.01M TBS 洗 5 分鐘×4 次。

    9.DAB 顯色。

    10.蘇木素輕度復染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。

    結果判定細胞核固縮有的呈碎片狀,不規則,大小不一致,呈棕黃色顆粒者為陽性細胞。 即

    凋亡的細胞

    TUNEL 改良方法在細胞凋亡檢測中的應用

    材料和方法

    1.1 材料 取手術下新鮮組織,恒冷切片 5μm,4%多聚甲醛緩沖ye固定 4-8 小時,載玻片

    用 APES 處理,同時連續切片、1%火棉膠、0.01MPpH7.4PBS、3%H2O2、1.0M 枸櫞酸

    鹽緩沖ye、通透ye(0.1%Triton-100、0.1 枸櫞酸鈉)、標記緩沖ye(pH6.8):二甲胂酸鈉

    100mmol/L 標記、二巰基蘇糖醇 0.1mmol/L,氯化鈷(coci)。

    * TdT 反應ye;標記緩沖ye(pH6.8)中加 TdT 酶 100U/ml,biotin-dUTP;鏈霉菌素標記的

    辣根過氧化物酶,蛋白酶 K(20μg/ml)。

    * 顯色劑 氨乙基咔唑(amino ethyl carbazole,AEC)的 配制AEC 20mg

    二甲酰胺 DMF 2.5ml

    0.05M 醋酸緩沖ye(pH5.5) 50ml

    0.3%H2O2 0.5ml

    1.2 實驗步驟

    (1)切片用冷風吹干后為防止冰凍切片脫片用 1%火棉膠封片 1 分鐘,PBS 漂洗 3×5 分鐘;

    (2)3%H2O2 阻斷 10 分鐘后 PBS 洗 3×5 分鐘;

    (3)組織切片浸泡于盛有 1.0mol/L 枸櫞酸鹽緩沖ye的燒杯中,置于微波爐內,在 650W,

    輻射時間 15min 的條件下進行組織處理。冷卻至室溫。

    (4)放在通透ye(0.1%Triton -100 溶于 0.1%枸櫞酸鈉溶ye)中室溫 20 分鐘,PBS 漂洗

    3×5 分鐘;

    (5)滴加 50μl TdT 反應ye 37℃1h,PBS 漂洗 3×5 分鐘;(6)滴加 50μl biotin-dUTP,反

    應ye 37℃1h,PBS 漂洗 3×5 分鐘;(7)滴加 50μl 鏈霉菌標記辣根過氧化物酶ye 37℃孵育

    30 分鐘,(8)PBS 漂洗 3×5 分鐘, AEC-H2O2 顯色 10-15 分鐘,蘇木素復染(用 1%的酸

    性水分化),水洗、水溶性封片。陽性對照 dTd 反應前用 20μg/ml 蛋白酶 K 處理切片。陰

    性對照用 PBS 代替 dTd 反應ye。

    1.3 結果判斷及標準 改良的方法:凋亡細胞核呈紅色固縮,有白邊集或碎列,細胞膜皺褶,

    有的卷曲和出泡,在計數時避開壞死區域,以避免假陽性。計數 500 個細胞中的凋亡細胞

    數目,得出凋亡百分率。凋亡染色分度如下:每個高倍視野平均 1-3 個為Ⅰ級;3-6 個為Ⅱ

    級;6-10 個為Ⅲ級;>10 個者為 IV 級。陽性對照:經在 dTd 反應認前用 20μg/ml 蛋白酶,

    處理切片 30 分鐘的切片同改良方法基本相同,但紅色較淺。陰性對照:切片無棕色反應。

    評價正常的或正在增殖的細胞沒有 DNA 的斷裂,沒有 3’-OH 末端被標記,因此鏡下無顯色的

    物質。這種分子生物學與形態學相結合的方法,可以對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進

    行標記,準確反應細胞凋亡典型的生物化學與形態學特征,靈敏度遠遠高于一般的組織化

    學和生物化學方法。在檢測過程中,可設陰性對照(不加 TdT)陽性對照(已知的陽性標本)。

    注意:AEC 孵育切片,反應產物為紅色??捎锰K木精對襯染色,反應產物是純酒精溶性的,

    因此??捎盟嵝运躽e分化,然后用水溶性封固劑封片。

    五、凋亡細胞:凝膠電泳檢測

    前已提及凋亡細胞的突出特征是由于內源性核酸內切酶的激活而導致細胞核 DNA 的斷裂。

    典型的細胞凋亡,在核內形成大量 200bp 大小及其倍體的核苷酸片段,而非典型的凋亡細

    胞,由于核內的 DNA 降解不完全,僅形成 300~50kb 的 DNA 大片。利用這一特性,可通

    過 DNA 凝膠電泳來判定凋亡的發生和發展情況。

    試劑

    1. PBS 緩沖ye

    2. 消化ye的配制:

    100mmol/L NaCl

    10mmol/L Tris-HCL(pH8.0)

    25mmol/L EDTA(pH8.0)

    0.5%SDS

    0.2mg/ml 蛋白酶 K

    3. 酚:氯fang:異戊醇混合ye按 25:24:1 比例配制。

    4. 氯fang:異戊醇混合ye按 24:1 比例配制。

    5. 醋酸銨,7.5mol/L。6. 100%和 70%的乙醇。

    7. TE 緩沖ye(pH8.0):100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA。

    8. TBE 緩沖ye。

    9. 電泳儀。

    10. UV 透射儀。

    11. 照相設備。

    12. 不含 DNA 酶的 RNA 酶。

    13. 2%凝膠的配制:取凝膠粉 2g,溶于 100ml 0.5 倍的 TBE 緩沖ye中,加熱至沸騰,攪

    拌使其均勻。待凝膠溫度降至 50℃時,倒入模板待其凝固。

    14.溴化乙啶(EB):10mg/ml 水溶ye。

    15.DNA 分子量標準物(Bio-Rad Lab,hercules,CA,USA)。

    操作步驟

    1.培養的懸浮細胞經離心(300g,5min)去上清ye后,用冷(4℃)PBS 緩沖ye洗滌二次;培養

    的貼壁細胞經用胰蛋白酶消化后收集,同樣方法洗滌二次,離心并去掉上清,僅留細胞沉積

    物。

    2.向細胞沉積物中加入消化ye,混勻后,于 50℃孵育 12-16h。

    3.用酚:氯fang:異戊醇混合ye抽提一次,再用氯fang:異戊醇混合ye抽提二次。其中每次加入

    抽提ye后混勻 5min,然后以 3600g 離心 5min,吸取抽提物。

    4.向抽提物中加入 醋酸銨,至終濃度為 2.5mol/L,混勻后,加入二倍體積的 100%乙醇,

    4℃下靜置 2h。

    5.將抽提物以 12000g 在室溫下離心 30min,棄去上清。

    6.用 70%乙醇重復上述步驟,洗滌一次,棄去上清。7.真空抽干或空氣干燥 DNA 抽提物。

    8.將提取的 DNA 用 TE 緩沖ye溶解。

    9.取 10μl 溶于 TB ye的 DNA 抽提物,加入 0.1U 的無 DNA 酶的 RNA 酶,于 37℃孵育 1h。

    10.吸取樣品,在 2%的凝膠孔內加樣;并在第1孔內加入分子量標記物。

    11.將凝膠置于 0.5 倍 TBE 緩沖ye的電泳槽內,按 4V/cm 電壓電泳 7h。

    12.將電泳后的凝膠置于 0.5μg/ml 的 EB 水溶ye中染色 30min。

    13.用雙蒸水洗滌凝膠 1~2h,其間換水數次。

    結果觀察

    將凝膠置 UV 透射儀上觀察:典型的凋亡能看到 200bp 及其倍體的 DNA 梯帶。

    1 陰性對照

    2 細胞色素誘導 16 小時

    3 細胞色素誘導 36 小時(凋亡)

    4 細胞色素誘導 72 小時(凋亡)

    凝膠電泳特點

    (1) 本方法不能檢測單個細胞水平的凋亡。

    (2) 不能提供細胞發生凋亡所處的組織位置和細胞分化狀態。

    六、熒光染料染色-流式細胞測定凋亡細胞

    * 細胞凋亡在細胞學上發生一系列特征性變化,如細胞周期停滯、細胞膜表面蛋白質分子表

    達的水平及類型發生改變、細胞膜皺縮引起光散射性質發生相應的變化等。在細胞凋亡的早

    期,細胞對前向角光散射的能力顯著下降,但是對 90°角光散射的能力增加或沒有變化。前

    向角散射的上升或下降與細胞的大小有關,90 °角散射的改變與細胞內結構,特別是染色質的濃縮有關。

    * 在細胞凋亡晚期,前向角和右向角光散射的能力均降低。因此,通過流式細胞儀檢測細胞

    光散射的改變可以獲得凋亡細胞的一些信息。但是,細胞的機械損傷、分離獲得的細胞核、

    以及壞死細胞的前向角光散射能力也均表現下降。另外,晚期凋亡細胞,細胞膜表面蛋白可

    能丟失,凋亡細胞表型復雜化也使光散射能力的分析出現復雜的結果,因此單純前向角光散

    射降低不是凋亡細胞特有的標志。

    * 根據碘化丙啶(PI)只能使壞死細胞著色,而雙苯并咪唑(Ho)卻可穿越細胞膜對活細胞和凋

    亡細胞的 DNA 進行染色,在紫外光激發下產生不同顏色熒光的特點,因此采用單一 PI 或

    者 Ho 染色法,或者應用兩種染料通過復染并結合流式細胞儀的精確分析,可達到對凋亡細

    胞、壞死細胞和活細胞進行鑒別與定量的目的。

    七、電子顯微鏡觀察法

    透射電子顯微鏡已經用于凋亡細胞的檢測。鏡下可見凋亡細胞體積變小、細胞質濃縮、細胞

    核變小、染色質濃縮并凝結成塊,出現染色質沿核膜內側排列的核邊集現象。晚期的凋亡細

    胞,清晰可見細胞核裂解產生的凋亡小體。

    八、PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測:

    原理

    凋亡早期,細胞內膜的磷脂酰絲氨酸(PS)移位到細胞外膜,而熒光標記或生物素偶聯的

    annexin V(磷脂結合蛋白)極易檢測處于外膜的 PS,由于 PS 外膜化比凋亡引起的核酸變化

    更早,所以該試劑盒比 DNA 檢測法能更早期檢測細胞凋亡。九、mRNA 水平的檢測

    一些基因在細胞凋亡時表達異常,檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種

    常用方法。 作為凋亡前期( Bax )或抗凋亡( Bcl-2 和 bcl-X )的調節物,它們的表達

    水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。因此,通過定量 PCR(Quantative PCR)檢測這些

    凋亡相關基因 RNA 水平的表達,也可以對凋亡進行評價

    十、凋亡相關蛋白 TFAR19 蛋白的表達和細胞定位分析

    該分子表達廣泛,在原核和真核生物不同種屬間具有很高的同源性。該分子具有促進某些腫

    瘤細胞(HL60、MGC-803、MCF-7 等)凋亡的效應,可作為早期凋亡的信號評價指標。

    十一、活細胞 Bid(蛋白)轉位檢測

    Bcl2 家族蛋白 Bid 通常情況下位于細胞漿內,但在凋亡發生時,Bid 迅速轉入線粒體內,并

    引發了細胞色素 C 的釋放,因此,通過 Bid 蛋白的檢測可以監視凋亡前期的生化反應。

    細胞凋亡相關抗體

    * Fas(CD95)Monoclonal Antibody

    * Granzyme B Monoclonal Antibody

    * Fas Monoclonal Antibody

    * Apoptosis Sample

    * Bak Antibody

    * Bcl-xL Antibody

    * Caspase-10 Antibody

    * Cleaved Caspase-3* Cleaved DFF45(D224)Antibody

    * Cleaved PARP(D214)Antibody

    * DFF45/DFF35 Antibody

    * Phospho-Bcl-2(Ser70)Antibody

    細胞凋亡的醫學意義

    1. 凋亡在發生學中的作用

    ①在胚胎發育、器官形成過程中,必然伴隨著某些特定細胞群的凋亡,這些細胞群的凋亡是

    受基因控制的,可準時發生,呈現生理性細胞死亡或進行性細胞凋亡。

    ②淋巴系統的陰性選擇(negative selection),指在 T 淋巴細胞、B 淋巴細胞分化成熟時,

    機體經過嚴格的選擇機制,使那些編排細胞表面受體基因發生錯誤的細胞,以及有可能導致

    自身免疫性疾病的細胞(具有自身抗原的細胞)發生凋亡,使得淋巴細胞在成熟過程中,有

    95%的細胞以凋亡的方式被清除,僅有 5%左右的淋巴細胞從中樞免疫器官中被分化成熟。

    ③神經元發育過程中也存在陰性選擇機制,以清除那些有害的(即發生錯誤連接的)或無用的

    神經元,因此,有 50%的神經元細胞在發育成熟前以凋亡的方式被清除。

    2.凋亡與疾病

    現已發現凋亡機制的異常,即凋亡的增加或被抑制與一系列疾病的發生有關。

    (1)凋亡減少(抑制)所引起的疾病

    ①惡性腫瘤:有濾泡性淋巴瘤、P53 突變性腫瘤、激素依賴性腫瘤(乳腺癌、前列腺癌、卵

    巢癌)。

    ②自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡、自身免疫性腎小球腎炎。

    ③病毒感染性疾病如對皰疹病毒、麻疹病毒、腺病毒易感性引起的疾病。

    (2)凋亡增多引起的疾?、偕窠浽冃?,如帕金森病、側索硬化、色素性視網膜炎、小腦變性。

    ② 骨髓發育不良綜合征,如再生性障礙性貧血。

    ③ 缺血性損傷,如心肌梗死、卒中、再灌注性損傷。

    ④ 中毒性肝炎,如酒精性肝病。

    凋亡除與某些疾病發生有關,而且對許多疾病的治療有著極大的現實意義。腫瘤患者可通過

    基因治療啟動細胞凋亡機制,也可通過藥物(化療)來誘導和加速腫瘤細胞凋亡,以控制腫瘤

    的發展,并使其緩解。如在外科手術及器guang移zhi中的再灌注性損傷,可采取啟動抗凋亡基因

    或應用抗凋亡藥物,來促進愈合和恢復功能。

     

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