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    細胞周期測定實驗

    發布時間:2020-03-16瀏覽:1270次

    細胞計數法:

    實驗方法原理 體外培養細胞 生長、分裂繁殖的能力,可用分裂指數來表示。它與生長曲線

    有1定的聯系,如隨著分裂指數的不斷提高,細胞也就進入了指數生長期。

    分裂指數指細胞 群體中分裂細胞 所占的百分比,它是測定細胞 周期的1個重要指標,也

    是不同實驗研究選擇細胞的重要依據。

    實驗材料 細胞

    試劑、試劑盒 胰酶 甲醇 培養液 冰醋酸 Giemsa 染液

    儀器、耗材 CO2 培養箱 普通顯微鏡 培養皿 蓋玻片 吸管

    實驗步驟 1、消化細胞 ,將細胞 懸液接至內含蓋玻片的培養皿中。

    二、CO2 培養箱中培養 48 小時,使細胞長在蓋片上。

    三、取出蓋片,按下列順序操作:

    PBS 漂洗 3 分鐘→甲醇:冰醋酸=3:1 固定液中固定 30 分鐘→Giemsa 液染色 10 分鐘→

    自來水沖洗。

    四、蓋片晾干后反扣在載玻片上,鏡檢。

    五、計算

    分裂指數=分裂細胞 數/總細胞 數×100%

    展開

    注意事項 1. 操作時動作要輕,以免使蓋片上的細胞脫落。

    其他 1、Giemsa 染液配制

    稱 Giemsa 粉末 0.5 g,加幾滴甘油研磨,再加入甘油(使加入的甘油總量為 33 ml)。56℃

    中保溫 90-120 分鐘。加入 33 ml 甲醇,置棕色瓶中保存,此為 Giemsa 原液。使用時按要求用 PBS 稀釋。1般稀釋 10 倍。

    BrdU 參入法

    實驗方法原理 細胞周期指細胞1個世代所經歷的時間。從1次細胞分裂結束到下1次分裂

    結束為1個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。

    單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法,但它不能代表細胞群體的周期,故現多采用其

    他方法測群體周期。

    BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養基后,可做為細胞 DNA 復制的原料,經過兩個細

    胞周期后,細胞中兩條單鏈均含 BrdU 的 DNA 將占 l/2,反映在染色體上應表現為1條單

    體淺染。如經歷了三個周期,則染色體中約1半為兩條單體均淺染,另1半為1深1淺。細

    胞如果僅經歷了1個周期,則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例,就可算出細胞周期的

    值。

    實驗材料 細胞

    試劑、試劑盒 BrdU 甲醇 冰醋酸 Giemsa 染液 秋水仙素 SSC 檸檬酸三鈉 NaCl

    儀器、耗材 冰箱 玻片 水浴鍋 鍋蓋 紫外燈 光學顯微鏡

    實驗步驟 1、試劑配制

    1. BrdU 配制

    BrdU 10 mg 加雙蒸水 10 ml ,4℃下避光保存。

    2. 2×SSC 配制

    NaCl 1.75 g,檸檬酸三鈉 0.88 g,加水至 100 ml,4℃保存。

    二、細胞生長至指數期時,向培養液中加入 BrdU,使zui終濃度為 10 μg/ml。

    三、44 小時加秋水仙素,使每 ml 中含 0.1 μg。

    四、48 小時后常規消化細胞至離心管中,注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。五、常規染色體制片。

    六、染色體玻片置 56℃水浴鍋蓋上,鋪上 2×SSC 液,距紫外燈管 6 cm 處紫外照射 30 分

    鐘。

    七、棄去 2×SSC 液,流水沖洗。

    八、Giemsa 液染色 10 分鐘,流水沖洗,晾干。

    九、鏡檢 100 個分裂相,計第1、二、三、四細胞期分裂指數。

    十、計算

    細胞周期(Tc)=48/(小時)

    展開

    其他 1、細胞周期介紹

    細胞周期(cell cycle)是指細胞從前1次分裂結束起到下1次分裂結束為止的活動過程,分

    為間期與分裂期兩個階段 。

    1. 間期

    間期又分為三期、即 DNA 合成前期(G1 期)、DNA 合成期(S 期)與 DNA 合成后期(G2

    期)。

    (1)G1 期

    此期長短因細胞而異。體內大部分細胞在完成上1次分裂后,分化并執行各自功能,此 G1

    期的早期階段特稱 G0 期。在 G1 期的晚期階段,細胞開始為下1次分裂合成 DNA 所需的

    前體物質、能量和酶類等。

    (2)S 期

    S 期是細胞周期的關鍵時刻,DNA 經過復制而含量增加1倍,使體細胞成為 4 倍體,每條

    染色質絲都轉變為由著絲點相連接的兩條染色質絲。與此同時,還合成組蛋白,進行中心粒復制。S 期1般需幾個小時。

    (3)G2 期

    為分裂期做zui后準備。中心粒已復制完畢,形成兩個中心體,還合成 RNA 和微管蛋白等。

    G2 期比較恒定,需用 1~1.5 小時。

    2. 分裂期

    細胞的有絲分裂(mitosis)需經前、中、后,末期,是1個連續變化過程,由1個母細胞

    分裂成為兩個子細胞。1般需 1~2 小時。

    (1).前期(prophase)染色質絲高度螺旋化,逐漸形成染色體(chromosome)。染色

    體短而粗,強嗜堿性。兩個中心體向相反方向移動,在細胞中形成兩極;而后以中心粒隨體

    為起始點開始合成微管,形成紡錘體。隨著核仁相隨染色質的螺旋化,核仁逐漸消失。核被

    膜開始瓦解為離散的囊泡狀內質網。

    (2)中期(metaphase)細胞變為球形,核仁與核被膜已完全消失。染色體均移到細胞的

    赤道平面,從紡錘體兩極發出的微管附著于每1個染色體的著絲點上。從中期細胞可分離得

    到完整的染色體群,共 46 個,其中 44 個為常染色體,2 個為性染色體。男性的染色體組型為

    46,XY,女性為 46,XX。分離的染色體呈短粗棒狀或發夾狀,均由兩個染色單體借狹窄的

    著絲點連接構成。

    (3)后期(anaphase)由于紡錘體微管的活動,著絲點縱裂,每1染色體的兩個染色單

    體分開,并向相反方向移動,接近各自的中心體,染色單體遂分為兩組。與此同時,細胞波

    拉長,并由于赤道部細胞膜下方環行微絲束的活動,該部縮窄,細胞遂呈啞鈴形。

    (4)末期(telophase)染色單體逐漸解螺旋,重新出現染色質絲與核仁;內質網囊泡組

    合為核被膜;組胞赤道部縮窄加深,zui后完全分裂為兩個 2 倍體的子細胞。

    在體內根據細胞的分裂能力可把它們分為三類:①增殖細胞群,如造血干細胞,表皮與胃腸粘膜上皮的干細胞。這類細胞始終保持活躍的分

    裂能力,連續進入細胞周期循環。

    ②不再增殖細胞群,如成熟的紅細胞、神經細胞、心肌細胞等高度分化的細胞,它們喪失了

    分裂能力,又稱終末細胞(end cell)。

    ③暫不增殖細胞群,如肝細胞、腎小管上皮細胞、甲狀腺濾泡上皮細胞。它們是分化的,并

    執行特定功能的細胞,在通常情況下處于 G0 期,故又稱 G0 期細胞。在某種刺激下,這些

    細胞重新進入細胞周期。如肝部分切除術后,剩余的肝細胞迅速分裂。

    流式細胞儀

    實驗方法原理 流式細胞儀的工作原理是將待測細胞放入樣品管中,在氣體的壓力下進入充

    滿鞘液的流動室。在鞘液的約束下細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出,形成細胞柱。通過對

    流動液體中排列成單列的細胞進行逐個檢測,得到該細胞的光散射和熒光指標,分析出其體

    積、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等物理及化學特征。

    細胞內的 DNA 含量隨細胞周期進程發生周期性變化,如 G0/G1 期的 DNA 含量為 2C,而

    G2 期的 DNA 含量是 4C。利用 PI 標記的方法,通過流式細胞儀對細胞內 DNA 的相對含量

    進行測定,可分析細胞周期各時相的百分比。

    實驗材料 HeLa 細胞

    試劑、試劑盒 乙醇 RNase-A PI PBS

    儀器、耗材 流式細胞儀 細胞培養設備 離心機 水浴 冰箱 注射器 離心管 封口膜 微量移

    液器

    實驗步驟 1、取對數生長期細胞,倒去培養液,胰酶適度消化細胞,用培養液吹打,800 rpm,

    離心 15 min 去上清。二、PBS 洗 2 次,加 0.5 mL PBS 吹勻,務必吹散。

    三、用 5 mL 注射器將細胞吸起,用力打入 5 mL 70%(預冷)乙醇中,封口膜封口。4℃固定

    過夜(可長至 2 周)。

    四、800 rpm 15 min 收集固定細胞,PBS 洗 2 次。

    五、用 0.4 mL PBS 重懸細胞并轉至 Tube 中輕輕吹打(防止細胞破碎)。

    六、加 RNase-A 約 3 μL 至終濃度約為 50 μg/mL ,37℃水浴消化 30 min;

    七、加 PI 約 50 μL 至終濃度約為 65 μg/mL ,在冰浴中避光染色 30 min。

    八、用 300 目(孔徑 40~50 微米)尼龍網過濾,上機檢測。

    九、樣品分析測定及打印。

    其他 1、常見問題

    1. Q:要做胃粘膜組織的 DNA 含量及倍體檢查,但取材后要等幾個星期才會做流式細胞

    術檢查,請問:胃組織要怎樣保存好呢?用低溫保存,還是用乙醇固定?或者固定后再低溫

    下保存?

    A:我做過乳腺細胞的 DNA 含量測定,取得組織以后,先處理成單細胞懸液,然后再加 70%

    冰乙醇固定,要保證冰乙醇的zui終濃度為 50%,這樣固定的細胞懸液可以至少保存 12 小時,

    zui多可保存1個月,上機檢測前再加 PI 綜合染液。我就是這樣做的,保存了將近三個星期,

    結果還可以,變異系數為 5%.

    2. 實驗中想用 PI 分析細胞周期及凋亡率,請教幾個問題:

    Q:(1)所用的 RNAs 酶用什么配制呢?用 PBS 配嗎?

    A:RNaseA 用 PBS 配制沒有問題,但是注意要沸水浴去除 DNase 的活性。

    Q:(2)測細胞周期和凋亡率時都要用 RNAs 酶,可以1起檢測嗎?A:用流式細胞儀測定時細胞周期和凋亡率是同時測定的,不用擔心。

    Q:(3)Triton-x-100 是固定劑吧,用了 70%的冷乙醇(是 4℃嗎?),是不是就不用

    Triton-x-100 固定了?

    A:Triton X-100 是起透化作用的,不是固定劑,可以用 75%的乙醇于-20 度固定。

    Q:(4)還要設什么內參標準(5%雞紅細胞)嗎?

    A:對照肯定是需要的,這個根據自己的需要進行設置。

    Q:(5)不用試劑盒行不行???

    A:完全可以不用試劑盒。

    以下提供1個自己的實驗步驟供參考:

    (1)200×g 離心 10min 收集細胞;

    (2)棄去上清,PBS 漂洗1次,將細胞重懸于預冷的 80%乙醇中,-20°C 固定 24h 以上;

    (3)進行流式細胞儀檢測前,200×g 離心 10min 收集固定后的細胞;

    (4)PBS 洗滌1次,200×g 離心 10min 收集細胞;

    (5)將細胞重懸于含 100ug/ml RNase A 和 50ug/ml PI 的 PBS 中,室溫孵育 30min;

    (6)將經 PI 染色和 RNase A 消化后的細胞懸液用 300 目的尼龍膜過濾后即可利用流式細

    胞儀進行細胞周期分布和凋亡細胞定量的分析。

    3. Q:流式檢測細胞周期時加 RNA 酶所需的溫度?

    A:其實有關 RNA 酶在凋亡檢測制樣過程中使用的必要性問題尚有人持不同意見,該觀點

    的人認為 RNA 酶在環境中*,常規制樣過程中所接觸的試劑和環境中的 RNA 酶已

    足以降解樣品中的 RNA,所以為了簡便實驗操作,也有人不加 RNA 酶或如你所參考的方

    法將其與 PI 染液1起使用。不過經典的方法還是“先加 RNA 酶 37 度孵育 30min,然后加PI 4 度孵育 30min”。

    至于染色時使用 4 度,是因為低溫可減弱分子運動,增強熒光染料結合的穩定性和減少可

    能的熒光損耗。上流式前細胞用 75%乙醇固定行嗎?

    4. Q:我養腫瘤細胞,測周期??吹教诱f 70%乙醇必須用 PBS 和乙醇配,用水配細胞

    會碎裂,有帖子說 PBS 和乙醇配會出現絮狀物。上流式前細胞用 75%乙醇固定,就用買來

    的現成的瓶裝 75%乙醇,行嗎?必須那么嚴格嗎?

    A:先用冷 PBS 懸浮細胞,大約 1-2ml,充分懸浮,使細胞充分分散成單細胞。之后緩慢

    加入無水乙醇,終濃度為 70-75%乙醇。不直接加 75%乙醇的原因是:直接加入乙醇會導

    致細胞團聚的現象,很難重懸成單細胞。乙醇固定之后沒有細胞沉淀。

    5. Q:我要做流式分析細胞周期,我大概收集了 10 的 6 次方細胞,但細胞在乙醇固定之

    后,還看到有細胞沉淀的,但 PBS 洗滌兩次之后,就基本沒什么細胞沉淀了,上機發現就

    發現不了細胞了。這是怎么回事???怎么解決這個問題???

    A:很可能是洗細胞的過程中丟失了,解決辦法有:

    (1)盡量采用尖底的離心管和水平離心機

    (2)離心后盡量用吸管吸取上清,不要傾倒;吸上清時殘留 1mm 左右的水膜,不要

    吸完。

    (3)離心的轉速或時間可稍微增加1點兒

    (4)每次加抗體時,吸頭不要接觸液面;混勻時不要用吸頭吹打,以免吸頭掛壁

    帶走部分細胞。

     

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