免疫共沉淀 Co-IP 實驗操作步驟

一、原理：

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為ji礎

的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用

的有效方法。其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質

－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質 X 的抗體免疫沉淀 X，那么與 X 在體

內結合的蛋白質 Y 也能沉淀下來。目前多用精制的 prorein A 預先結合固化在 argarose

的 beads 上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads 上的 prorein A 就能吸附抗原

達到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；也可用于確定一

種特定蛋白質的新的作用搭檔。

其優點為：（1）相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的，處于天然狀態；（2）蛋白

的相互作用是在自然狀態下進行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態

的相互作用蛋白復合物。缺點為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質

相互作用；（2）兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作

用；（3）必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇后檢測的抗體，所以，若預測不

正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。

二、準備工作：

預冷 PBS，RIPA Buffer，細胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機

1. 用預冷的 PBS 洗滌細胞兩次，后一次吸干 PBS；2. 加入預冷的 RIPA Buffer(1ml/107 個細胞、10cm 培養皿或 150cm2 培養瓶，

0.5ml/5×106 個細胞、6cm 培養皿、75cm2 培養瓶)

3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下，把懸液轉到 1.5EP 管中，4℃，

緩慢晃動 15min（EP 管插冰上，置水平搖床上）

4. 4℃，14000g 離心 15min，立即將上清轉移到一個新的離心管中

5. 準備 Protein A agarose，用 PBS 洗兩遍珠子，然后用 PBS 配制成 50%濃度，建

議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠

6. 每 1ml 總蛋白中加入 100μl Protein A 瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃 10min（EP

管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景

7. 4℃，14000g 離心 15min，將上清轉移到一個新的離心管中，去除 Protein A 珠

子

8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋 1：10 倍

以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月）

9. 用 PBS 將總蛋白稀釋到約 1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白

在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高（如 10 μg/μl）

10. 加入一定體積的兔抗到 500μl 總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞

系中的多少而異

11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫 2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用 2

h 室溫孵育12. 加入 100μl Protein A 瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混

合物過夜或室溫 1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加 2 μl"過渡抗體"（兔抗鼠 IgG，

兔抗雞 IgG）

13. 14000rpm 瞬時離心 5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，用預冷的

RIPA buffer 洗 3 遍，800μl/遍，RIPA buffer 有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內

部的結合，可以使用 PBS

14. 用 60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量

依據上樣多少的需要而定（60 μl 足夠上三道）

15. 將上樣樣品煮 5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余

瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應再次煮 5min 變性。

RIPA Buffer 配制：

ji礎成分：

Tris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性）

NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集）

NP-40（非離子去污劑，提取蛋白；用 H2O 配制成 10%儲存液）

去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用 H2O 配制成 10%儲存液；避光保存）

注意：準備激酶（致活酶）實驗時，不要加去氧膽酸鈉，因為離子型去污劑能夠使酶

變性，導致活性喪失。

RIPA 蛋白酶抑制劑苯甲jihuang酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成 200mM 的儲存液，室溫保存）

EDTA（鈣螯合劑；用 H2O 配制成 100mM 的儲存液，PH 7.4）

亮抑酶肽（Leupeptin）（用 H2O 配制成 1mg/ml 的儲存液，分裝，-20℃保存）

抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用 H2O 配制成 1mg/ml 的儲存液，分裝，-20℃保存）

胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成 1mg/ml 的儲存液，分裝，-20℃保

存）

RIPA 磷酸（酯）酶抑制劑

激活的 Na3VO4（用 H2O 配制成 200mM 的儲存液，見 Sodium Orthovanadate

Activation Protoco）

NaF（200mM 的儲存液，室溫保存）