作者：毛博

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很多時候，我們千辛萬苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子。但是卻不知道如何正確地分

析，得出理想的結果。這實在是一件憾事。

其實，免疫組化結果分析的 protocol 教科書和實驗手冊上面都有。今天主要談談應該注意的

一些事項和技巧，并且有獨門絕招獻上，都是干貨喲。

對照染色

和做實驗的時候必須設立對照組一樣，免疫組化也必須設立對照染色。沒有對照染色的免疫

組化結果是不可信的。對照一般有陽性組織對照，陰性組織對照，陰性試劑對照，自身對照。

一般來說，有一個陽性組織對照和一個陰性組織對照就足夠了。

定位

抗原表達必須在特定部位。如 LCA 應定位在細胞膜上；CK 應定位在細胞漿內；PCNA 及 p53

蛋白應定位在細胞核內等等。不在抗原所在部位的陽性著色，不能視為確切的陽性結果。有

可能是非特異性染色或者假陽性。不能確定怎么辦？這就要用到上一段提到的對照染色了。

半定位

現在一般用圖像分析系統進行定量。如果你的實驗室不幸沒有那么高大上的話，就只好趕鴨

子上架，用肉眼定一下量了。因為人為主觀性比較強，所以只能稱作半定量。免疫組化的半

定量一般就分為三級：弱（+），中（++），強（+++）。以綠色免疫熒光為例，則表現為淺綠

色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1，中（++）=2，強（+++）=3。至少隨

機觀察 5-10 個 HPF。然后根據（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3 計算出數值；總數值

<1.0 者為（+），1.0-1.5 者為(++), >1.5 者為(+++)。圖像分析儀

如果要進行精確定量的話，就要用到圖像分析儀。圖像分析儀類型很多。這里就不一一介紹

了。其實毛博想隆重推薦的是一款圖像分析軟件：Image J。毛博當年在米國做博士猴的時

候，就是用的這款軟件。這是 NIH 開發的免費軟件。一般的免疫組化結果分析用它就綽綽有

余了?，F在已經開發到了 1.50 版。網上可以免費下載。其界面非常簡潔，如下圖所示。

現在，根據一個實例來看看如何用 Image J 來進行圖像分析。如下圖所示，我們有一張細胞

的免疫熒光染色的照片。那么，如何用 Image J 來計數細胞的個數呢？

671首先，要把彩色的圖像轉換成黑白圖像。步驟如下：Image→Type→16-bit。轉換成黑白圖像

后，將要計數的部分用高亮標示出來。步驟如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖動鼠標，

直到所有的細胞被標示出來。

672有時候 2 個細胞靠得比較緊密，會被計數為 1 個細胞。這個時候可以采用 Image J 的水洗功

能。步驟如下：Image→Binary→Watershed。如下圖的藍色箭頭所示，這些是本來計數成一個

的細胞，經過水洗之后，更加精確地被計數成了 2 個細胞。

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然后，就可以正式開始分析了。步驟如下：Analyze→Analyze Particles。在得出后的結果之

前，還有一些選項需要選擇。如果想要計數全部的細胞，那么 Size 項里面選擇“0-infinity”。

Circularity 的默認值為“0.00-1.00”。一般就取默認值。

后的結果如下圖所示。軟件自動測量了每個細胞的大小。這里因為是二維圖像，所以就是

每個細胞的面積。然后計數了一共有 72 個細胞，總面積為 21286.00，平均大小為 295.64。免疫組化是個苦活，時間長，步驟多，還要經常接觸有毒致癌物質。大家辛辛苦苦染出了漂

亮的片子，后都希望得出自己想要的結果。以上介紹了一些自己的心得體會。希望廣大的

實驗狗們都能做出自己想要的結果，早點發文章。