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    DNA 的提取

    發布時間:2020-07-07瀏覽:829次

    一、原理 采用堿變性發抽提取質粒DNA。該法是基于染色體DNA與質粒DNA的變性預復性的 差異而達到分離目的的。在PH大于12的堿性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋 結構解開變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價閉合環狀結構的兩條互補鏈 不會完全分離,當以pH5.2的乙酸鈉高鹽緩沖液調節其pH 至中性時,變性的質粒DNA又 恢復到原來的構型,保存在溶液中。而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構。通過 離心,染色體DNA與不穩定的大分子RNA,蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除 去。 二、方法 1. 挑取一環在LB固體培養基平板上生長的含PUC57質粒的大腸桿菌,接在含有100μ g/ml氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養基(5ml/15ml試管)中,37℃震搖培養過 夜。 2. 將1.5ml菌液加入微離心管中,14000r/min,離心 10秒,其取上清液。反復數次,收 集全部菌體。 3. 傾去上清,濾紙吸干。 4. 加30μlTE緩沖液(10mmol/L   Tris—HCl,1mmol/L   EDTA,pH8.0),振蕩起菌體。 5. 加30μlTENS溶液(10mmol/L   Tris—HCl, pH8.0,1mmol/L   EDTA,0.1mol/L  NaOH,0.5%SDS),震蕩10秒至溶液變粘稠。 6. 加150μl 3.0mol/LnaAC,震蕩3—5S,14000r/min,離心3分鐘,沉淀細胞碎片及染 色體DNA。 7. 上清液轉移至另一微離心管中,甲等體積胞和酚,混勻,12000r/min,離心2分鐘。 8. 上層水相轉移至另一位離心管,加2倍量冷水乙醇,14000r/min,離心20分鐘。 9.傾去乙醇,加入7o%冷乙醇淋洗。 10.傾去乙醇,濾紙吸于,真空抽吸2~3分鐘。 lI.加人50μlTE緩沖液,溶解DNA。 12,加入1μl核糖核酸酶(10mg/m1),14000r/min,離心2s,使核糖核酸酶與管底液體混 勻。 13.37℃水浴30min。 14.樣品放一20℃冰箱保存備用。   三、試劑 1.TE緩沖液(10mmol/L   Tris—HCl,1mmol/L   EDTA,pH8.0) 配制方法: Tris        1.211g EDTA.Na     0.037g 用800ml重蒸水溶解,用分析純鹽酸調整pH至8.0,加重蒸水定容至1000ml。 2.TENS溶液:(10mmol/L   Tris—HCl, pH8.0,1mmol/L   EDTA,0.1mol/L  NaOH,0.5%SDS)
        配制方法:     NaOH    O.4 g     SDS     0.5 g 加80mlTE緩沖液溶解。加TE緩沖液定容至lOOml. 3.3.0mol/1醋酸鈉溶液(pH5.2) 配制方法:醋酸鈉    24.6g 用70ml重蒸水溶解,再用冰乙酸大約調pH至5.2,加重蒸水定容至100ml。 純凈的酚使用時不需要重蒸。市售的酚一般為紅色或黃色結晶體,使用之前必須重蒸,除去 能引起DNA和RNA斷裂和聚合的雜質。將苯酚置于65℃水浴中溶解,重新進行蒸餾,當 溫度升至183℃時,開始收集在若干個棕色瓶中。純酚和重蒸酚都應貯存在-20℃使用前取 一瓶重蒸酚于分液漏斗中,加入等體積的lmol/L Tris-HCI(pH8.0)緩沖液,立即加蓋,激 烈振蕩,并加入固體Tris搖勻調pH(一般100ml苯酚約加l克固體Tris)分層后測上層水相 pH至7.6一8.0。從分液漏斗中放出下層酚相于棕色瓶中,并加一定體積0.1mol/L TrisHCI(pH8.o)覆蓋在酚相上,置4℃冰箱貯存備用。酚是一種強腐蝕劑,能引起腐蝕性損 傷,操作時應戴上眼鏡和手套。如果皮膚上濺上了酚,應用大量水沖洗或用肥皂水沖洗。酚 在空氣極易氧化變紅,要隨時加蓋,也可加入抗氧化劑o.1%8一羥基喹啉及o.2%β— 巰基乙醇。 5.無水乙醇 置-20℃冰箱中保存備用 6.70%乙醇 置-20℃冰箱中保存備用 7.核糖核酸酶(10mg/ml) 配制方法:稱取l0mg核糖核酸酶A(RNaseA,美國 SIGMA或中科院上海生物化學研 究所東風試劑廠)。于滅菌的微離心管內,加1 ml 100mmol/pH5.0的NaAC溶液(完全溶 解),即為10mg/ml RNase,為了破壞脫氧核糖核酸酶(DNase,置80℃水浴中10min或 100℃水浴2 min,然后置一20℃(或家用冰箱的冰格內)保存。
     
    四、材料
     
    1.菌種: 大腸桿菌(pUC57) 2.培養基 LB液體培養基 精解蛋白胨  3g 酵母浸出粉  1.5g 氯化鈉    3 g 葡萄糖    0.6g
        按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示,下同)溶解至300ml。用10mol/LnaOH 調 pH至7.2~7.4。分裝于15ml試管中,每支5ml。然后置高壓蒸汽消毒鍋以1.1kg/ cm2滅菌20min.
     
      l抗菌素:   氨芐青霉素(Amp)臨用時用無菌水配制在無菌有蓋試管中,濃度為100mg/m1。   五、儀器: 恒溫振蕩器。 低溫冰箱-20℃ 真空泵。 臺式高速離心機 六、說明     1.質粒DNA提取的方法很多,有堿變性法、羥基磷灰石柱層析法、溴化乙錠一氯化銫 梯度超離心法等。本次實驗是一種小量快速提取法。小量快速提取法也有多種,但基本原理 和步驟是一致的.包括下述步驟:(1)裂解菌體細胞;(2)質粒和染色體DNA的分離;(3)除 去蛋白質。RNA及其他影響限制性酶活性的細胞成分;(4)除去提璣過程中使用的去垢劑、 鹽 等。     2.在基因操作實驗中.保存或提取DNA過程中,一般都采用TE緩沖液,而不選用其它 的緩沖液。雖然很多緩沖系統.如磷酸鹽緩沖系統,硼酸系統都符合細胞內環境的生理范 圍,可以作為DNA的保存液,但在某些實驗中,這些緩沖對會影響實驗。如在轉化實驗 中,要用到Ca+,如果川磷酸鹽緩沖液,磷酸根將與Ca2+產生Ca(PO4+沉淀;在各種工具 酶反應時,不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同,有的要求高鹽離子濃度,有的則要 求低鹽濃度,采用Tris—HCI緩沖系統,不存在金屬離子的干擾作用;作中的EDTA是二價 離子 Mg2+、Ca2+等的螯合劑,可降低系統中的這些離子濃度,而這些離產是脫氧核糖核酸酶的 輔 助因子,所以EDTA可以抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用。     3、TENS中NaOH:核酸在pH大于5,小于9的溶液中穩定,怛當pH大于12 或小于3 時,就會引起DNA兩條鏈之間氫鍵的解離而變性。TENS中有NaOH使其pH大于 12, 因而 使染色體DNA與質粒DNA變性。     TENS中的SDS:SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有:(1)溶解細胞膜上的脂肪與 蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜;(2)解聚細胞中的核蛋白;(3)SDS能與蛋白質結合 成為R1 一O一SO3…R2+一蛋白質的復合物,使蛋白質變性而沉淀下來。但是SDS能抑制 核 糖核酸酶的作用,所以在以后的提取過程中,必須把它去干凈,防止在下一步操作中(用
    Rnase去除RNA時)受干擾。     4、3.0mol/L NaAC(pH5.2)使pH 大于12的DNA抽提液回到中性,使變性的質粒 DNA 能夠復性,并能穩定存在。染色體DNA不能復性(染色體DNA不存在超螺旋共價閉合環結 構)  而高鹽的3mol/L  NaAC有利于變性的大分子染色體DNA、RNA、以及SDS—蛋白質 復合物凝聚沉淀。pH5.2也能中和核酸上的電荷,減少相互斥力而互相聚合。同時,鈉鹽 能與 SDS一蛋白質復合物作用后,形成溶解度較小的鈉鹽形式復合物,使沉淀更完全。     5.飽和酚:酚是一種表面變性劑,屬非極性分子。水是極性分子。當蛋白質溶液與酚混 合合時,蛋白質分子之間的水分子被酚擠走,使蛋白質失去水合狀態而變性。經過離心。變 性蛋白質的密度比水的密度大,因而與水相分離,沉淀在水相下面,酚比重更大,保留在 下層。酚作為變性劑.也有一些缺點:(1)酚與水有一定程度的互溶,酚相中水的溶解可達大 約10%~15%,溶解在這部分水相中有DNA會損失,(2)酚很容易氧化,變成粉紅色,氧 化的酚容易降解DNA,解決酚氧化和帶水的辦法是將酚重蒸,除去氧化的部分,再用Tris —HCl緩沖液飽和,使酚不至于奪去DNA中的水,帶走部分DNA。飽和酚中加上8一羥 基硅啉及巰基乙醇,防止酚氧化,還是弱的螫合劑.可抑制DNase。由于有顏色.溶解在 酚中后,使酚帶上 顏色,便于酚相與水相的分肉,酚飽和后,表面蓋上一層Tris水溶液,隔絕空氣,阻止酚氧 化。     6.關于無水乙醇沉淀DNA的說明:     用無水乙醇沉淀DNA,是實驗中zc用的沉淀DNA的方法。乙醇的優點是具有極性, 可以以任意比例和水相混溶,乙醇與核酸不會起化學反應,對DNA很安全,因此是理想的 沉 淀劑。     乙醇之所以能沉淀DNA,是由于DNA溶液是以水合狀態穩定存在的DNA,當加入乙 醇.乙醇會奪去DNA周圍的水分子,使DNA失水而易于聚合沉淀,一般實驗中,用2倍 體積 的無水乙醇與DNA相混合。使乙醇的終含量占67%左右。由此可預見,也可用95%乙 醇 沉淀DNA,但是用95%乙醇使總體積增大.而DNA在醇溶液中總有一定程度的溶解。因 而 DNA損失也增大,影響收率。     乙醇沉淀DNA溶液時,DNA溶液中應該有一定的鹽濃度,中和DNA表面電荷。如果溶 液中鹽濃度太低,要加NaAC或NaCl至終濃度O.1一O.25mol/l在pH 8左右的DNA 溶液中,DNA分子帶負電荷,加一定濃度的NaAC或NaCl使Na+中和DNA分子上的負 電荷,減少DNA分子之間的同性電荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。當加 入的鹽溶液濃度太低時。只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合,這樣就造成DNA沉淀不
    完全。但當加入的鹽溶液濃度太高時,其效果也不好,在沉淀的DNA中,由于過多的鹽雜 質存在,影響DNA的酶切等反應,必須進行洗滌或重沉淀。     乙醇沉淀DNA.一般采用低溫條件,這是由于在低溫條件下.分子運動大大減少,DNA 易于聚合而沉淀。為了使質粒DNA能充分沉淀,一般保存時間總是過長的,同時也要視樣 品的體積而異,在微量離心管中的樣品要比40毫升離心管中DNA樣品的量少,冷卻就較 迅速。大量提取DNA時,目前習慣上常采用如下幾種方法: 保存在家用冰箱結冰盒內    過夜 保存在-2℃亡冰箱內        過夜 保存在-70℃冰箱內          30mm~2h 放置干冰中(約-20℃)      30min 放置干冰加酒精中(約-70℃)  16mm     放置在液氮缸中液氮的氣相內,不可以浸在液氮中(溫度在-198℃左右)5~15min。     除了用乙醇外還可用1倍體積丙醇(相當于2倍體積乙醇)使DNA沉淀。用異丙醇的好處 是要求離心的液體體積小,但異丙醇揮發性不如乙醇,終除區其殘留部分的難度更大。 此外,異丙醇能促使蔗糖、氯化鈉等溶質與DNA一起沉淀,在-70℃時,更易發生,所以 一 般以乙醇沉淀為宜,除非要求液體體積很小。     7.影響質粒DNA提純質量和產率因素的說明。     (1)菌株     質粒的宿主菌菌株的不同對質粒DNA純化的質量和產率很大。一般zh選用enA基因 突變的宿主菌,即enA-菌株,如DH5α,JMl09和XL1—Blue等。使川含野生型enA基因 的菌株會影響質粒DNA的純度。     enA基因是核酸內切酶I。核酸內切酶I是一種12kDa的壁膜蛋白,受鎂離子激活,可被 EDTA抑制,對熱敏感。雙鏈DNA是核酸內切酶I的底物,但RNA是該酶的競爭性抑制 劑.能改變酶的特異性,使其由水解產生7個堿基的寡聚核苷酸的雙鏈DNA內切酶活性, 變為平均每底物每次切割一次的切口酶活性。核酸內切酶I的功能仍不清楚,enA基因突變 的菌株沒有明顯的表現改變,但質粒產量及穩定性明顯提高。細菌不同生長期核酸內切酶I 的 表達水平不同。生長的指數期較穩定期核酸內切酶I水平高300倍。此外,培養基中促進快 速生長的成分如高葡萄糖水及補充氨基酸都會使核酸內切酶I水平增高。     此外,菌株的其他性質有時也應加以考慮。如XL1—Blue生長速度較慢。,HBl01及其衍 生菌株如TG1及JMl00序列,含大量的糖,這些糖如果在質粒純化過程中不除去,在菌體 裂解后釋放出來,可能抑制酶活性。     (2)質粒的拷貝數     細菌中質粒的拷貝數是影響質粒產量的主要的因素。質粒的拷貝數主要由復制起點 (replication origin)如pMBl及pSC101及其附近的DNA序列決定。這些被稱作復制點的 區域通過細菌的酶復合物控制質粒DNA的復制。當插進一些特殊的載體時,能降低質粒的 拷貝
    數。此外,太大的DNA插入也能使質??截悢迪陆?。一些質粒,如pUC序列,由于經過 了突變和改造,在細菌細胞內的拷貝數很大.以pBR322質粒為基礎的質??截悢递^低,粘 粒(cosmid)及特別大的質粒通??截悢禈O低(表1)。
     
    表I各種質粒和粘粒的復制起點和拷貝數
     
    載體                          復制起點             拷貝數               特點
     
    質粒                            pUC 載體                       ColE1               500~700            高拷貝 pBluescript 載體               ColE1               300~500            高拷貝 pGEM 載體                      pMB1                300~400            高拷貝 pTZ 載體                       pMB1                >1000               高拷貝 pBR322 及其衍生質粒            pMB1                15~20              低拷貝 pACYC  及其衍生質粒            p15A                1O~12              低拷貝 psc101 及其衍生質粒            psc101              ~5                 極低拷貝 粘粒 SuperCos                       ColE1               10~20              低拷貝       PWE15                          ColE1               10~20              低拷貝
     
    (3)細菌培養 用于制備質粒的細菌培養應該從選擇性培養的平板中挑取單個菌落培養。不應該直接從 甘油保存菌,半固體培養基及液體培養基中挑菌,這可能導致質粒丟失。也不該從長期保存 的平板上直接挑菌,這也可能使質粒突變或使質粒丟失。挑取單個菌落至3ml選擇性培養基 中,培養至飽和狀態(12~14小時)就可進行小量質粒提取。     8.除了本實驗采用的小量質粒DNA提取法外,很多生物試劑公司還提供試劑盒用于小 量質粒DNA的提取。通常情況下.采用試劑盒都能獲得較高質量的DNA,所得到的DNA 都可直接用于傳染、測序及限制酶分析等。下面介紹三種試劑盒。     A.用Bio—Rad質粒小量制備試劑盒提取質粒DNA     (1)取過夜培養的菌液l~2ml至微離心管中。離心30s沉淀細胞,吸去所有上清。     (2)加200μl細胞懸浮液(Cell Rcsuspension Solution) 并吹打數次(或旋渦振蕩),使沉淀 完全懸浮。     (3)加250μl細胞裂解液(Cell Lysis Solution),輕輕顛倒管l0 次(不旋渦振蕩)如果細胞裂 解了,溶液應變得粘稠且稍清亮。如果仍然渾濁,繼續混合。     (4)加250μl中和液(Neuralization Solution),輕輕顛倒管10次(不旋渦振蕩)混合(此時 應該形成可見沉淀)。     (5)在微離心機上以zg轉速(12 000~14 000g)沉淀細胞碎片5min。在管底或沿著管壁 有緊密白色沉淀。
        (6)將一支過濾柱(Spin Filter)插在一支新離心管上。     (7)直接吸200μl基質懸液(Quantum Prep Matrix)到含白色沉淀的管中(吸基質中成份 前,徹底混合基質),為避免管壁有沉淀,吹吸2次混合,立即直接將懸液倒在過濾柱(Spin Filter)內,當所有樣品轉移到過濾柱內后,離心30s。     (8)從微離心管上移開過濾柱,棄去離心管底的濾液。     (9)再放過濾柱到同一管上。加500μl洗滌液(Wash Solution)洗滌基質(dy次使用前 加63ml 95%乙醇到洗滌液中),離心30s。     (10)從微離心管上移開過濾柱,棄去離心管底的濾液,再放過濾柱到同一管上。     (11)加500μl洗滌液洗滌基質,離心2nun,除去殘存的乙醇。移開過濾柱,棄去離心 管。     (12)放過濾柱在一新離心管上,加100μl去離子水或TE,離心30s洗脫DNA。棄去過濾 柱,將洗脫的DNA保存在-20℃。     B.用泛特津公司的日常型質粒DNA小量制備試劑盒提取質粒DNA     (1)取5ml過夜培養的菌液,用臺式離心機zg速度離心lmin,棄盡上清。     (2)加入250μlS1 溶液懸浮細菌,加入250山S2 溶液,混和但充分地上下混合均勻3~4 次。     (3)加400μl 4℃預冷的S3溶液,溫和但充分地上下混合均勻.靜置2min。     (4)將溶液連同凝結塊一起轉入到微量濾器中,1000r/min離心30s,使溶液直接過濾到 2ml離心管中。     (5)將過濾液從2ml離心管中轉入到DNA小量制備管中,3600r/min離心lmin。     (6)棄2ml離心管中溶液.將DNA小量制備管重新置回到2ml離心管中。     (7)加500μl W1溶液,3600r/min離心1min,棄 2ml離心管中溶液,將DNA小量制 備管重新置回到2ml離心管中。     (6)加650μl S5 溶液,3600r/min離心lmin。     (9)將DNA制備管移人另一2ml離心管中,再加650μl S5溶液,1200r/min離心 2min。     (10)將小量制備管移到1.5ml離心管上,加60μl 65℃預熱的TE緩沖液于DNA結合膜 中間,室溫下置lmin,1200r/min,離心1min,洗脫質粒DNA。     C.用Qiegan質粒DNA小量制備試劑盒(P1asmid Mini Kit)提取質粒DNA   試劑盒組成
     
    質粒提取試劑盒(Plasmid Kits)       小量25次(Mini 25)   小量100次(mini 100) 廠家目錄號(Catalog No.)                    12123                12125
     
    純化柱(QIAGEN—tip 20)                      25                  100 Pl緩沖液(Buffer,P1)                       20ml                 40ml P2緩沖液(Buffer,P2)                       20ml                 40ml P3緩沖液(Buffer, P3)                       20ml                 40ml
    QBT緩沖液(Buffer QBT)                      40ml                 110ml QC緩沖液(Buffer QC)                        120ml                480ml QF緩沖液(Buffer QF)                        30ml                 110ml RNase A(100mg/ml)                          2mg                  4mg 使用手冊(Handbook)                          1                    1
     
        實驗步驟 (1)取3nd過夜培養的菌液,用臺式離心機zg速度離心,棄去上清。沉淀用0.3ml含 Rnase A的P1 緩沖液(Buffer P1)溶解。     注:P1緩沖液在使用前應該加人試劑盒中提供的RNase A溶液.Rnase A溶液加入 P1緩沖液前.可先短時高速離心至管底。含Rnase A的P1緩沖液可于2~8℃保存6個 月.     (2)加0.3m1 P2緩沖液(Buffer P2),輕輕顛倒管4~6次混勻(不要旋渦振蕩),室溫放 置5 min。     注:裂解反應時間不要大干5 min。P2緩沖液開蓋取完試劑后.立即重新;旋上蓋 子.以免試劑中的NaOH與空氣中的CO2反應。     (3)加0.3ml預冷的P3緩沖液(Buffer P3),立即輕輕顛倒管     (4)再次混勻樣品,在臺式離心機上以大轉速(10 000—13 0OOr/ min或14 000~18 000r/ min)離心10 min,移出上清, 注:離心后,上清應該時清亮的.如果上清不清亮,再次離心至上清清亮,不清亮的成 分將堵塞柱子,使流速清亮。 (5)用lml  QBT緩沖液(Buffer QBT)平衡QIAGEN—tip 20,讓補上液體自然(以重力) 流干。 (6)向QIAGEN-tip 20柱上加入步4收集的上清,讓上清自然(以重力)流人柱中。 上清盡快加人到柱中.如果存放時間太久.由于蛋白質沉淀變混,上樣前應重新離心, 以免堵塞柱     (7)用4 X 1ml,緩沖液(Buffer QC)洗滌QIAGEN—tip 20柱。    ‘     (8)用O.8ml緩沖液(Buffer QF)洗脫DNA。     (9)用0.7體積(0.8ml 洗脫流出液則為0.56ml)室溫放置的異丙醇沉淀離心機上≥10 000r /min離心30 min,小心倒出上清。 (10)用1ml 70%乙醇洗滌DNA,空氣干燥5 min,以適當體積緩沖液重新溶解 DNA。     試劑     (1)P1緩沖液(菌體重懸緩沖液):50mmol/l Tris-HCl,pH8.0;10mmol/L EDTA;100 /μg/ml RnaseA 4℃保存。 配制方法:Tris 6.06 g,EDTA·2H2O 3.72 g,用 800ml ddH2O溶解,用HCl調pH 至8.0加ddH2O至1000 ml。1000 ml P1緩沖液中加入100 mg RNaseA。 (2)P2緩沖液(裂解緩沖液):200mmol/L NaOH,1%SDS。室溫保存。
    配制方法:NaOH 8.0g溶于950ml ddH2O中,加入50 ml 20%SDS溶液加 ddH2O 至1000 ml。 (3)P3緩沖液(中和緩沖液):3.0mmo]/L乙酸鉀,pH5.5。室溫或4℃保存 配制方法:乙酸鉀294.5g溶于500 ml ddH3O中,用冰乙酸(約110m1)調pH至5.5 加ddH2O至1000 ml。     (4)QBT緩沖液(平衡緩沖液):750mmol/L NaCl; 50mmol/L MOPS,pH7.O;15%異 丙醇;0.15%Triton X—100。室溫保存。     配制方法:NaCl 43.83g,MOPS(自由酸)10.46g溶于860ml ddH2O。調pH至7.0。 加150 ml純異丙醇及15 ml lO% TritonX—100溶液,加ddH2O至1000ml。 (5)QC緩沖液(沖洗緩沖液):1.0mmol/L NaCl;50mmol/L MOPS,pH7.0;15% 異丙醇。室溫保存。        配制方法:NaCl 58.44g;MOPS(自由酸)10.46g溶于800 ml ddH2O 。調pH7.0。加 150ml純異丙醇,加ddH2O至1000ml。     (6)QF緩沖液(洗脫緩沖液):1.25mol/L NaCl;50mmol/L Tris HCl,pH8.5;15%異 丙醇。室溫保存。 配制方法:NaCl 73.05g,Tris 6.06g,溶于 800ml ddH2O。用HCl凋pH 至 8.5。加150ml純異丙醇,加ddH2O至1000ml。 (7)TE:10mmol/L Tris-HCl,pH8.O,1mmol/L EDTA。室溫保存。 (8)STE:100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl,pH8.0,1mmol/L EDTA。室 溫保存。 配制方法:NaCl 5.84g,Tris 1.21g,EDTA·2H2O 0.37g,溶于800ml ddH20中,用 HCl調pH8.0,加ddH2O至1000ml。
     

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