人子宮頸鱗癌細胞

人子宮頸鱗癌細胞，SiHa操作說明

請仔細閱讀本操作說明及相應的細胞說明書。
收貨
<1>本公司的人子宮頸鱗癌細胞，SiHa發貨有四種形式：T25瓶、離心管、血清及干冰。
T25是用T25細胞培養瓶直接發貨的形式。收到細胞后，拆開包裝T25瓶的自封袋，不拆封口膜，表面噴75%酒精消毒后顯微鏡觀察細胞狀態（有條件可以拍下此時細胞照片）。將細胞放入37度培養箱平衡兩小時以上，再處理細胞。首先將T25中培養基取出裝好備用，如細胞密度高于80%，可以直接消化傳代，相反則加入5-6mL培養基放回培養箱繼續培養即可。
離心管是用15mL離心管發貨的方式，只用于懸浮細胞發貨。收到細胞后消毒處理及平衡參考上述T25瓶。平衡完成后，離心（1000rpm，3min）收集細胞，棄上清，用新的培養基重懸細胞并接種至培養瓶或皿中，放回培養箱繼續培養。
血清是用牛血清直接發貨的形式，是細胞凍存管加入含有細胞的牛血清的形式。收到細胞后，拆開自封袋，凍存管表面噴75%酒精消毒后，在超凈臺中打開凍存管，將細胞用1mL槍頭輕輕幾次以將細胞吹勻，接種至含有預熱的培養基的培養瓶或皿中，顯微鏡下觀察細胞是否吹勻，如果沒有吹勻，繼續吹勻至3-5個細胞一團，放回培養箱繼續培養。
干冰是用本公司凍存液凍存細胞后，直接用干冰將凍存的細胞冷凍發貨的形式。收到細胞后按照細胞復蘇的步驟操作即可。
<2>相關問題
如不能在收到后及時操作細胞，T25及離心管發貨的細胞可以消毒后在37度過夜，血清發貨的細胞可以在室溫下靜置1-2天（注意不要放冰箱），干冰發貨的可以在確認干冰未完全升華時將細胞直接放回液氮或者-80度冰箱，若干冰完全升華，請即刻復蘇細胞。
T25瓶及離心管在培養箱平衡是為了讓細胞盡快適應培養箱環境，同時使部分因運輸導致脫落的細胞貼壁，此步驟非常必要。T25瓶如果在顯微鏡下可以看到部分不貼壁的細胞，可以收集上清后離心（1200rpm，5min）后，將沉淀用新的培養基重懸后接種至新的培養瓶或皿中。
部分細胞在運輸過程中，由于不斷震蕩及環境不適，可能導致細胞破碎死亡，從而使培養基中漂浮很多細胞碎片及顆粒狀物質。這種情況下，平衡后，貼壁細胞用PBS洗兩遍在加新的培養基培養或者傳代至新瓶中培養即可；懸浮細胞可以離心（1000rpm，3min）收集細胞，并用PBS重懸后再離心一次，再用新的培養基重懸并接種細胞。

細胞培養及傳代
<1>細胞培養
細胞請于細胞培養箱中培養，大部分細胞是37℃，5% CO2，濕度100%環境下培養的。有極少部分細胞培養條件不*，請仔細閱讀相應的細胞說明書，使用正確的培養基及培養條件；
細胞于培養瓶或皿中培養，加入適量說明書上標注的細胞相應完全培養基（一般液面高度2-3mm即可）。
<2>細胞傳代（以下步驟適用于10cm皿）
細胞培養至密度達80%以上時即可傳代，先將細胞培養基取出3mL用15mL離心管裝好，其他培養基全部吸干舍棄；
培養皿加入2-3mL無菌PBS，輕輕晃動皿，使PBS浸洗到皿底所有部位，PBS吸干舍棄；
加入1mL胰酶，輕輕晃動皿，使胰酶浸沒到皿底所有部位，將皿蓋好放入培養箱中消化；
3min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞不再貼壁，即可加入*步收集的培養基混勻；
若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至不貼壁為止；
將細胞懸液均勻分成幾份，分別加入不同培養皿中，補加新培養基后放回培養箱培養。
<3>相關問題
部分細胞在傳代后時，會有以下現象：細胞內會有黑色小點、細胞間隙有些顆粒物、培養基漂浮一些死細胞或者細胞長的極慢。出現以上現象時，可以咨詢本公司技術人員此現象是否正常及相關處理方式，不要頻繁換液，大多數細胞1周換液2-3次即可。
細胞碎片較多、背景較臟時，貼壁細胞用PBS漂洗兩次、懸浮細胞打散后低速離心（900rpm，3min）能有效改善。
傳代比例建議1:2-1:3，長得比較快的細胞可以1：3，比較慢的按1:2傳代。傳代后，建議不要使用傳代前培養所使用的培養基，會有大量細胞碎片甚至導致細胞死亡的風險。
細胞狀態不好或者生長極慢的時候，可以通過增加血清濃度調整細胞狀態及生長速度。
請不要隨意更換培養基，因實驗需要，可以逐步馴化。
懸浮傳代：混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用完全培養基重懸接種到新的培養皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗一次。
細胞凍存
<1>凍存操作
凍存液配方：建議使用92%FBS+8%DMSO，客戶自身實驗室所使用的凍存液也可以適用，血清濃度不低于30%，DMSO含量不高于12%即可。
收集細胞按照以上細胞傳代步驟操作至第④步后，將細胞懸液收集入15mL離心管，離心（1200rpm，3min）；
棄上清，加入配制好的凍存液，重懸細胞，懸液加入無菌凍存管中；
將凍存管在4℃靜置10min，后將之正置于室溫下的厚壁有蓋泡沫盒中，蓋緊盒蓋，放入-80℃冰箱過夜，第二天放入液氮即可長期保存。